Подложка изоплат: Страница не найдена

Подложка Изоплат под ламинат, преимущества и укладка Isoplaat

Длительное использование напольного покрытия из ламината с условием сохранения его привлекательного внешнего вида возможно только при использовании качественной подложки. Многие выбирают пенополиэтилен, но если для хозяев важно, чтобы все материалы были экологически чистыми, то им идеально подойдет подложка под ламинат Изоплат.

Перед тем, как укладывать ламинат на жесткое основание, необходимо позаботиться о наличии подложки. Этот слой напольного покрытия выполняет множество функций, в том числе, он отвечает за сохранение тепла и нераспространение шума.

Одной из разновидностей подложки является натуральный материал, выпускаемый под маркой Изоплат. Он имеет хорошие отзывы и обладает отличными эксплуатационными характеристиками.

Что за материал подложка Изоплат

Подложка марки Изоплат – это материал на натуральной основе. Для его изготовления используется древесные опилки. В качестве связующего применяются натуральные смолы хвойных деревьев. Таким образом, материал, хотя и не является природным, но изготавливается из натуральных компонентов.

Свойства

Подложка Изоплат обладает следующими свойствами:

• Как и прочие древесные материалы, Изоплат обладает способностью выравнивать влажность, изменения которой провоцируются перепадами температур.
• Материал абсолютно нетоксичен, даже в процессе горения он не выделяет ядовитых веществ.
• Отличное сопротивление давлению, поэтому подложка может применяться в помещениях с большой нагрузкой на напольное покрытие;
• Изоплат, выполненный из древесных стружек, является хорошим звукоизолятором, поэтому его рекомендуется применять под ламинат в многоквартирных домах, где шумоизоляция очень важна. Материал обладает уникальной способностью гасить ударные шумы.
• Высокие показатели теплоизоляции, это свойство особенно востребовано, если квартира находится на первом этаже, а под ней находится холодный подвал;
• Защита внутренней поверхности ламелей от губительного действия влаги. В бетонной стяжке, даже если она успела «отстояться», всегда содержится некоторое количество влаги, поэтому стелить ламинат непосредственно на бетон нельзя. Если подложки не будет, то выделяемая влага будет собираться на изнаночной поверхности напольного покрытия, способствуя его преждевременному разрушению.

Совет! Преимущество древесноволокнистых плит Изоплат в том, что они, в отличие от материалов на основе полиэтилена, влагу не накапливают. Древесина обладает способностью регулировать микроклимат.

Применять Изоплат рекомендуется и для выравнивания основания. Далеко не всегда черновой пол удается сделать идеально ровным, а наличие подложки способно компенсировать наличие небольших перепадов по высоте.

Толщина

Прежде чем купить Изоплат, нужно определиться с требуемой толщиной подложки, производитель предлагает несколько вариантов материала толщиной от 4 до 12 мм. При выборе оптимальной толщины необходимо принимать во внимание:

• качество чернового пола, наличие на нем неровностей и перепадов по высоте;
• конструкцию ламелей;

• расстояние между полом и дверным полотном;
• наличие под полом неотапливаемых помещений, например, подвала или гаража.

Поэтому нет универсального варианта материала, который подошел бы для всех квартир без исключения.

Как укладывается подложка Изоплат под ламинат

Прежде чем начать укладывать подложку, стоит убедиться, что черновой пол достаточно подготовлен. Он должен быть ровным, сухим и прочным. Если прежняя стяжка пришла в негодность, то придется ее заменить. Для выравнивания следует применять специальные самовыравнивающиеся смеси.

Совет! Если была сделана новая бетонная стяжка пола, то ей нужно дать время на высыхание. Минимальный срок «отстаивания» – 30 суток.

Если стяжка в хорошем состоянии, то ее нужно хорошо очистись от мусора и пыли до начала укладки подкладочного слоя.

Порядок выполнения работы

Прежде чем начать укладывать Изоплат под ламинат, необходимо оставить его в комнате, где будет меняться напольное покрытие, и оставить там на сутки или более. Это необходимо для того, чтобы показатели влажности воздуха в комнате и уровень влажности материала выровнялся. Рекомендуется установить плиты материала на решетчатый настил из брусьев. Это обеспечит равномерный доступ воздух.

При укладке плит требуется выдерживать компенсационные зазоры, это необходимо для исключения коробления покрытия при колебании уровня влажности в помещении. Размеры компенсационных зазоров:

• между отдельными листами – 2 мм;
• между покрытием и стенами – 10 мм.

Совет! Чтобы выдержать рекомендованную ширину зазора, рекомендуется отрезать куски от плит нужной ширины и укладывать в местах зазора. После завершения укладки подложки отрезки плит, уложенные в местах зазоров, удаляют.

Плиты нужно укладывать по диагонали, длинная сторона листов должна располагаться пол углом 45 градусов к направлению укладки ламелей. Если основа идеально выровнена, то разрешается укладывать плиты под углом 90 градусов к направлению монтажа ламелей.

Этот способ укладки позволяет сэкономить на материале. Нужно сделать, чтобы места стыков плит в рядах не совпадали, то есть, укладывать листы в шахматном порядке. Для крепления плит используют клей жидкие гвозди.

Если основание деревянное, то для крепления материала можно применять степлер. После завершения укладки подложки можно приступать к монтажу ламината.

Итак, Изоплат – это подложка, изготовленная из натурального сырья, поэтому она является экологически чистой. Материал имеет отличные отзывы и несмотря на то, что его стоимость несколько выше, чем у аналогов из полимеров, он пользуется устойчивым спросом.

Уникальные свойства древесины поглощать и отдавать влагу обеспечивают оптимальный микроклимат. Кроме того, материал облает отличными звуко- и теплоизолирующими свойствами. При соблюдении технологии монтажа подложка Изоплат существенно продлит срок службы ламината.

Хвойная Подложка под Ламинат (Steico и Isoplaat), Отзыв Мастера

 

Хвойная подложка, как и Tuplex, является типичным финским изобретением. У меня складывается впечатление, что в Европе, особенно в скандинавских странах, только и думают «чтобы такого придумать и заработать денег». Влюбленные в свой труд соседи с севера доводят до ума свои открытия, выпуская в свет новую продукцию — нужно отдать им должное. Правда, возможности реализовать свои идеи им легче, за счет более высокой финансовой и правовой грамотности.

Хвойная подложка: техническая характеристика, пояснения

Хвойная листовая подложка предназначена для использования в качестве тепловой и звуковой изоляции под паркетную доску или ламинат. Основой для материала служит древесина хвойных пород.

Ссылка на купить в Петровиче

Заказать в Леруа Мерлен

Купить в Максидоме

По утверждению производителей она изготавливается без добавления клея, поэтому является полностью экологически чистой, о чем есть подтверждения сертификатами.

Хвойная подложка

Стейко или Изоплаат состоит из целлюлозы, являющейся прочным каркасом. Лингин – связующее вещество и геммицеллюлоза, придающая упругость и эластичность.

Как говорится: «соль и сахар, ничего лишнего». Подложка обладает высокой прочностью на сжатие, но имеет высокую ломкость. В руках при небрежном обращении она крошится и ломается.

Помимо гигиенических, пожарных, сертификата качества и соответствия на официальном сайте Isoplaat (Изоплат) представлены протоколы испытаний по звукоизоляции на английском языке. Как известно, измерения по шумоизоляции проводят на предмет поглощения удара: она достигает более 20 дБ за тонкую подкладку и около 30 дБ за пластину 7 мм толщины.

Подложка визуально похожа на лист ДВП (древесно-волокнистая плита). Несмотря на высокую плотность, около 250 кг/м3, имеет пористую структуру, позволяющую некоторую излишнюю влагу впитывать в себя, рассеивая между волокнами. По заверениям мануфактуры еловую подкладку можно стелить непосредственно на сухое бетонное основание.

Судя по многочисленным отзывам — хвоя превосходно режется ножом, легко укладывается, прекрасно выравнивает основание, за счет большого выбора толщины подложки – возможно поднять по высоте с кафельной плиткой, впитывает излишнюю влагу, улучшает звукоизоляцию, повышает тепло самого пола.

Но это не совсем так.

Хвойная подложка плюсы и минусы

Читая огромное количество отзывов о хвойной подложке, представляем ровный, зеленоватого цвета композитный лист, который легко отрезать строительным ножом и настилать на пол. За счет большого количества толщин 3,4,5,7 мм можно выровнять уровень пола с плиточным покрытием в кухне или коридоре. Подкладка обладает достойной тепло, звукоизоляцией, сопротивлению к деформации.

Начнем с того, что, судя по некоторым отзывам, с подстилкой из хвои многие никогда не имели дело, а большинство статей просто друг у друга скопированы или написаны в рекламных целях. Не зная материала – легче напечатать «как у всех», чем проводить непопулярную разъяснительную работу. И так по порядку, с внешнего вида.

Продукция поставляется в листах, упакованных в пленку. Первое разочарование постигает при вскрытии упаковки. Пластины хвои почти всегда выгнутые, в большей или меньшей степени, не способные плотно прилегать к основанию. Может вины изготовителя нет и причиной является неправильные условия хранения, но факт остается фактом.

Далее рассказ буду вести, задавая возможные вопросы. Так будет удобнее.

Вопрос-ответ

Как правильно стелить хвойную подложку?

Правильная укладка подложки подразумевает ее диагональный способ настила относительно направления финишного напольного покрытия. При таком методе исключено попадание стыков соединений ламината на швы изоляционных пластин.

Почему необходима укладка подложки по диагонали относительно направления настила ламината, если она стелется вплотную между собой?

По аннотации изготовителя необходим отступ в 1-2 мм между листами. Прессованная хвоя — это древесина, имеющая свойства к расширению в зависимости от температурно-влажностных условий. При несоблюдении зазора изоляция может встать колом, поднимая напольное покрытие.

Кстати говоря, по причине неровности краев используемой продукции, под ней образуются пустоты. При настиле ламината конструкция начинает «проваливаться» под весом человека. Эта неприятность со временем уйдет посредством усадки, но поначалу возникнут вопросы к профессионализму мастеров, оставляя на душе неприятный осадок.

А как же тогда изменится звукоизоляция подложки, если между ней необходимо оставлять зазор?

На этот вопрос я ответа не знаю. Скорее всего, особо не изменится — звукоизоляция инсталляции рассчитывается на ударный шум.

Нужно ли под подложку стелить пароизоляционную пленку?

   

Производители ламината, паркетной доски для страховки всегда требуют укладку влагонепроницаемого полиэтилена, иначе изделие снимается с гарантии.

Изготовитель Изоплат (Isoplaat) Эстония утверждает: на сухой бетон подложку стелить допустимо, это связано с ее пористой структурой, способной рассеивать незначительное количество влаги.

 

Из личной практики: на межэтажное бетонное перекрытие такую подложку настилали, пока никто не обращался. Но был случай: сильно затопило заказчицу. Хвоя превратилась в жижу и разваливалась в руках, а мы работали без средств защиты дыхания. Надышались влажностными, прелыми парами, после чего 3 дня в горле стоял ком и текло из носа.

После выноса мусора на лестничную клетку взяли недельный перерыв на просушку, рекомендуя обработать основание антигрибковым составом, так как уже появлялась белая плесень и, местами, черная. В том случае ламинат настелили спустя неделю, женщина более не обращалась.

В итоге: стелить полиэтилен или нет – решать вам, хотя в описанной ситуации выше он бы не помог.

Производство заявляет о высокой экологичности подложки, так ли это?

Сертификаты, размещенные на сайте, подтверждают о самом высоком классе эмиссии М1 и возможности применения в бытовых условиях. Однако, при неоднократном монтаже подложки во время работы чешутся руки и колени. Дело в видимых глазу частицах волокна, похожих на иголки стекловаты. Исключение было во время одной из последних работ с подложкой фирмы Steico.

На поверхности находилась древесная пыль, но иглы не наблюдал. Постараюсь информировать вас, уважаемые читатели, о новых наблюдениях ниже, в комментариях.

Так же слышал отзывы о сильной впитываемой особенности запахов хвоей, но не сталкивался.

Чем еще можно поднять уровень ламината до высоты кафельной плитки в коридоре?

Наверное, больше нечем. Тонкую фанеру не рекомендую использовать, ее коробит при крепеже. Можно применить толстую подложку из экструдированного полистирола, но она дает значительную усадку. Лично видел, как лист 5 мм в процессе эксплуатации становился толщиной 2-3 мм.

Самый лучший вариант осуществить заливку пола наливными смесями или остановиться на первоначальном варианте.

Как фиксировать хвойную подложку или каким скотчем скреплять между собой?

На сайте производителя Isoplaat говорится о возможной фиксации подложки к основанию с помощью клея, при чем — в рекомендательном наклонении. Делаем вывод из предыдущего вопроса, что полиэтиленовую пленку настелить не удасться.

Бумажным скотчем или канцелярским между собой крепить подкладку смысла не имеет, так как ворсистость и пыльный налет не даст ей возможность нормально прихватиться. Помогает только металлизированная клейкая лента для скрепления всех типов подложек. Ее понадобится 1 рулон длиной 25 метров на 10 м2 настилаемого пола.

Так же успешно можно приклеить хвойную подложку на двухсторонний скотч. Как понимаете, поверхность для нанесения скотча должна быть хорошо подготовлена, очищена от пыли и мелкого мусора. Пленку в таких случаях применить не получится.

Хвойная подложка хорошо выравнивает пол за счет толщины?

Еловая подложка обладает самым сильным коэффициентом сопротивления к деформации до 20000 кг/м2. Поэтому способна выровнять лишь резкие перепады: выступающую головку шурупа, небольшой камушек, торчащую металлическую направляющую – все то, что имеет малую площадь; чтобы в дальнейшем, под весом ламината и мебели, продавить структуру изоляции и «встать на место». В противном случае, подкладка с напольным покрытием повторит и «запомнит» форму неровности пола.

Ко мне обратились люди с такой проблемой. Снимали старый паркет и бетонной стяжке остались гвозди. Да, я тоже думал, что ослышался или люди перепутали. Но на высланном фото они отчетливо видны. Затруднение вызвало вытаскивание гвоздей, ломались шляпки. Женщина спросила, можно ли их загнуть и добить? Почему бы и нет? Если не имеют возможности делать выравнивание пола и стелить фанеру. Возможно осуществление такого экономически выгодного варианта. В качестве подложки оптимально, в этом случае, использовать хвойную изоляцию.

Почему тогда подложка так популярна, в том числе в Европе

Прежде всего – это просто бизнес. Есть товар – нужно его продать.

А в Европе продукция из хвои в определенной степени популярна, ее использование предназначено в основном для деревянных полов. На дощатые основания не нужно класть пленку, подложку легче фиксировать клеем или с помощью степлера.

В России данный вид товара адаптировали к нашим условиям использования (бетонный пол квартиры), поэтому хвойная подложка вызывает столько вопросов и противоречий у покупателей и мастеров отделки.

Укладка хвойной подложки

Такую подложку стараемся не рекомендовать к использованию. Если стелить ее правильно, с соблюдением всех рекомендаций, диагонально, на клей с зазорами между собой – я просто останусь без работы. Присовокупив стоимость самой хвои около 150 руб/м2 и затрат на монтаж выйдет на укладку всего напольного покрытия значительная сумма плюс огромное количество времени.

Еловую подложку, как и большинство мастеров, укладываю по прямой или по диагонали. Настилая изоляцию наискосок, работаю только при отсутствии мебели. Стоимость такой инсталляции хвои стоит дороже.

Листы надрезаю строительным ножом, заламывай край материала. Это нужно делать аккуратно, подстилка сильно крошится. Соединяю встык друг к другу, отступая от края стены около 10 мм. Такого расстояния достаточно для возможности подвижек материала при смене времен года и влажности в квартире соответственно. Пароизоляционную пленку настилаю по желанию заказчика и по обстоятельствам.

По гарантийному, после гарантийному обслуживанию к нам заказчики не обращались.

В заключении небольшая таблица воздействию различных сред на исходный материал подложка Стейко (Steico) — Польша, 3мм. Испытание проводилось на огнеупорность и влагостойкость.

Таблица хвойной подложки Стейко 3 мм

Толщина «до» фактическая	Толщина «после»	Вес образца «до»	Вес образца «после»	Огонь
3.2 мм	3.5 мм	13 гр	66 гр	5 сек

Пятно от огня появилось спустя 2-3 секунды. До таких размеров, как на фото, дошло за 5 секунд. Разгоревшаяся на доли секунды пыль, думал, перекинется дальше, но этого не произошло. Неприятных запахов не было, из чего думаю, что материал полностью натуральный.

В воде комнатной температуры образец пролежал сутки, увеличив массу в 5 раз. При плотности в 250 кг/м3 пятикратный рост веса подразумевает впитываемость воды, как у губки.

Влагу эталонный образчик набрал моментально, практически, как только опустил в воду. Структуру подложка поменяла с твердой на тестообразную, с трудом сохранив форму через несколько часов.

Здесь можно прочитать статью о лучшей подложке под ламинат.

Отзывы и ваши мнения можно оставлять ниже, в комментариях

 

Хвойная подложка Изоплат 6 мм

2050 ₽ / уп

В наличии

хвойная подложка для звукоизоляции пола

Индекс звукопоглощения

Коэффициент звукопоглощения 22 дБ.

Применение

Шумоизоляционная подложка Изоплат 850х590х6мм применяется под ламинат и паркетную доску с целью улучшения теплозвукоизоляционных характеристик. Приглушая шум шагов, обеспечивая спокойствие и удобство в комнате. Выровнять небольшие недостатки пола можно при поддержке подложки Изоплат, что часто избавляет от надобности монтажа фанеры или дополнительной стяжки.  

Описание

ISOPLAAT (ИЗОПЛАТ) – напольная звукоизоляционная подложка Изоплат 850х590х6мм для паркета или ламината. Isoplaat экологически чистый продукт без применения искусственных склеивающих элементов. Шумоизоляционная плита Isoplaat имеет пористую структуру, что дает возможность не мяться долгое время, обеспечивая длительный промежуток работы. Антисептическая термообработка, употребленная к панели, не дает прогрессировать грибкам и плесени.

 

Состав

Хвойное волокно из натурального дерева                                                                                                                                               

Технология укладки

Подложку Изоплат перед монтажом необходимо выдержать в помещении в распакованном виде в течение 24 часов для выравнивания влажности материала. Подпольные плиты ISOPLAAT кладутся на основание в стык, при этом от стены задаётся промежуток до 1 см. Лучше всего выдержать такое расстояние, вставляя в этот промежуток куски самих же подпольных плит ISOPLAAT. После полного монтажа плитами Изоплат обрезки нужно вытащить. Плиты нужно укладывать на пол под углом 45° к стенам, чтобы исключить совпадение промежутков подложки и напольного материала. При укладке между плитами должен быть промежуток в 1-2 миллиметра. Монтаж напольного покрытия производится на напольные плиты ИЗОПЛАТ. По надобности плиты можно класть на клей. Инструкция по применению в пачке.

Хвойные подложки ISOPLAAT под ламинат и паркет

Развернуть описание

Подпольные подложки ISOPLAAT (ИЗОПЛАТ) под ламинат и паркет, разработаны специально для настила новых и ремонта старых полов.

Применение подложки

Корректировка поверхности чернового пола (бетонной стяжки либо деревянного настила), а также его утепление и звукоизоляция.

Наиболее часто подпольные плиты устанавливают под так называемыми «плавающими» паркетными либо ламинированными напольными покрытиями.

Преимущества подложки ISOPLAAT

Подложка Isoplaat обладает рядом несомненных преимуществ:

1. Подложка ISOPLAAT имеет высокую механическую прочность, благодаря которой способна выдержать давление на стыках до 20 т/м² Она не подвергается деформации под весом мебели, что нельзя сказать о 2-3 мм пленках. В то же время, благодаря пористости самого материала она остается легкой и довольно мягкой, за счет чего может с легкостью удалять и сглаживать дефекты основания пола. При толщине 5 или 7 мм устраняются неровности до 4 и 5 мм соответственно, что избавляет от необходимости укладки фанеры.
2. Подложки под ламинат и паркет ISOPLAAT / ИЗОПЛАТ — это отличный теплоизоляционный и звукоизоляционный материал. Благодаря уровню звукоизоляции -21 дБ плиты эффективно заглушают стук каблуков и снижают проникновение шума сквозь напольное покрытие, а коэффициент теплопроводности составляет 0,045 Вт/ (м·К), и позволяет приравнять материал плит к мягким утеплителям. Результаты многочисленных исследований показали — использование плит увеличивает температуру напольного покрытия, тёплые полы значительно увеличивают комфорт проживания.
3. Подложки под ламинат ISOPLAAT изготавливаются исключительно хвойной древесины, без добавления каких-либо химических связующих веществ, благодаря чему являются 100% экологически чистыми.
4. Подпольные плиты являются влаго и износостойкими, благодаря чему даже если на них попадет влага, она моментально высохнет, они не изменят свою изначальную форму и защитят ламинат от появления деформаций. Укладыватся плиты могут как на бетонные так и на деревянные перекрытия в сухих помещениях.
5. По таким характеристикам как теплопроводность, упругость, износостойкость, несдавливаемость, коэффициент звукопоглощения и естественность используемого материала ее можно приравнивать к пробке, но поскольку теплоизоляция пропорционально зависит от толщины материала, подложка ИЗОПЛАТ обеспечивает в 3 раза более теплый пол, чем пробка, а стоимость останется прежней.

Эстонская подложка ISOPLAAT Изоплат (Тихий Ход) 4 мм

Страна производитель:

Эстония

Формат подложки:

Листовая

Материал подложки:

Деревоволкнистая

Количество м2 в упаковке:

7 м2

Теплый пол:

Допускается

Размер:

850-590 мм

Теплопроводимость Вт/мК:

0,05

Звукоизоляция:

-21 Дб

Предназначение:

Под паркет и ламинат

 

  ISOPLAAT — разработаны на основе тепло-звукоизоляционной плиты, специально для настила как новых, так и ремонта старых полов. Выпускаются толщиной 4, 5 и 7 мм. Выравнивает поверхность чернового пола (бетонной стяжки или деревянного настила), обеспечивает теплоизоляцию и звукоизоляцию пола. Наиболее распространенным является использование подпольных плит ISOPLAAT под «плавающими» паркетными и ламинированными напольными покрытиями.Преимущества подложки Изоплат ISOPLAAT
Преимущества подпольной плиты Изоплат ISOPLAAT   1. Подложка ISOPLAAT имеет достаточную механическую прочность, чтобы выдерживать давление на стыках ламинированных плит до 20 т/кв.м. Подложка не сжимается и не деформируется под тяжестью мебели в отличие от тонких 2-3 мм подложек. При этом она пористая, легкая и нежесткая, поэтому выступающие дефекты основания пола прекрасно выравниваются. За счет толщины 5 или 7 мм выравниваются дефекты пола до 4 и 5 мм соответственно, что зачастую избавляет от необходимости дополнительно заливать пол самовыравнивающими смесями и укладки фанеры.   2. Поскольку плиты имеют пористую структуру, они обладают теплоизоляционными, звукоизолирующими, шумопоглощающими и акустическими свойствами. Плиты ISOPLAAT заглушают стук каблуков и снижают проникновение шума через пол. Звукоизоляция -21дБ, а коэффициент теплопроводности 0,045, а это значит, что по теплоизоляции материала близок к мягким утеплителям. Многочисленные исследования показали — использование плит увеличивает температуру поверхности пола, что создает дополнительный комфорт.   3. Подложка под ламинат ISOPLAAT изготовлена из хвойной древесины без добавления клея или других химических связующих, поэтому она на 100% экологически чистая.   4. Подпольные плиты укладываются на бетонные или деревянные основания в сухих помещениях, но разовое попадание влаги сквозь ламинат не приведет их к разрушению: высохнув, они сохранят форму.   5. По таким показателям как теплопроводность, упругость, долговечность, несжимаемость, коэффициент звукопоглощения и натуральность материала, ее можно сравнивать с пробкой, но поскольку теплоизоляция – это теплопроводность, умноженная на толщину материала, можно сказать, что подложка ИЗОПЛАТ – это в три раза большая теплоизоляция по той же цене.
Установка подложки ISOPLAAT:   Перед установкой необходимо выдержать подлжку в помещении в распакованном виде в течение суток для выравнивания влажности материала. Листы ISOPLAAT укладываются на бетонные или деревянные основания без использования клея или гвоздей.Инструменты для установки: острый строительный нож, линейка, угольник.Напольные плиты укладываются одна к другой под углом 45° по отношению к соединениям полового покрытия, во избежание совпадения зазоров между материалом покрытия и напольными плитами. Между стеной и плитами оставляются зазоры 5-10 мм на набухание.Между плитами следует оставить зазоры 1-2 мм. Для обеспечения лучшей устойчивости плит можно прикрепить их к основе несколькими каплями клея или скобой/гвоздем.     

цены и отзывы на Эко Трейд

Благодаря исключительным свойствам подложки из древесного волокна Isoplaat (подложки из двп), пол в комнате станет ощутимо теплее, т.к. подложка под ламинат из хвои — отличный теплоизолятор.

Плотность хвойной подложки под ламинат Изоплат подобрана таким образом, что небольшие неровности «чернового» пола будут выровнены и напольному покрытию будет обеспечено ровное основание.

Преимущества:
1) натуральная подложка из хвойных пород древесины
2) хорошая звукоизоляция
3) выравнивание основания
4) защита замков ламината и паркетной доски

Хвойная подложка укладывается под углом в 45 градусов по отношению к напольному покрытию, чтобы избежать совпадения стыков напольного покрытия и хвойной подложки. Дополнительного крепления к полу не требуется. Для удобства монтажа, подложка может быть приклеена к основанию на жидкие гвозди.

Подложка под ламинат 6 мм предназначается для использования во время создания нового или ремонта старого напольного покрытия на твердом и сухом основании. Данный материал разрабатывался исходя из технических характеристик теплоизоляционных плит этого же производителя. Благодаря пористой структуре этого материала осуществляется качественная тепло и звукоизоляция, а так же улучшается акустика в помещении. Плотность материала позволяет выровнять черновой пол, чтобы была возможной укладка основного напольного покрытия. В нашем интернет-магазине подложка 6 Isoplaat стоит гораздо дешевле, чем во многих других строительных магазинах. У нас вы можете купить подложку по наиболее выгодной цене.

Цена подложки 6 мм Isoplaat в нашем магазине выгодна и доступна.

Данный вид подложки обладает высоким уровнем теплоизоляции для обеспечения более комфортного и теплого пола, звукоизоляцией. Он создан из абсолютно натуральных экологических материалов без использования химических и синтетических составляющих. Подложка может легко и быстро устанавливаться даже непрофессионалами, так как она легка и проста в эксплуатации и не требует специальных навыков. Так же данный материал может использоваться при утеплении помещения. Наш каталог стройматериалов поможет вам выбрать именно тот материал, технические качества и дизайн которого соответствуют вашим желаниям и возможностям.

Хвойная подложка Isoplaat | Подложка под ламинат Изоплат

Область применения

Подложка под ламинат Isoplaat (хвойная подложка Изоплат) используется в качестве основания для деревянного или ламинированного паркета и паркетной доски. Плиты укладываются на твердые сухие основания (бетонную стяжку, деревянный каркас).

Фото

Внешний вид упаковки плит 5мм Внешний вид упаковки и плит 5мм Плиты 5мм Ламинат, уложенный на подложку

Преимущества хвойной подложки

• Подложка выдерживает давление на стыках до 20 т/м².
• Натуральные плиты. Изготовлены из хвойной древесины без добавления химических связующих и красителей. Склеивание волокон в ходе мокрого процесса производства происходит смолами, находящимися в дереве.
• Плиты сохраняют форму. В отличие от тонких синтетических покрытий, которые под давлением пола сдавливаются, теряют выравнивающий и звукоизолирующий эффект, приводят к поломке замков ламината, подложка Изоплат не деформируется со временем.
• Напольные плиты имеют пористую структуру, поэтому эффективно заглушают звук шагов и снижают проникновение звука через пол. Использование плит увеличивает температуру поверхности пола, что создает дополнительный комфорт.
• Подложка подходит для применения с теплыми полами.
• Подложка Isoplaat сглаживает небольшие неровности основания для пола.
• По многим характеристикам сравнима с пробковой подложкой при более низкой цене.

Отличия от других древесноволокнистых подложек

• Согласно проведённым испытаниям РУП «БелНИИС», подложка Isoplaat толщиной 7мм имеет предел прочности на сжатие при 10%-ной линейной деформации (по ГОСТ 17177) 286 кПа. Это значит, что подложка просядет на 10% в случае, если на 1 квадратный метр будет приложено сжимающее усилие более 29 тонн! Такими результатами не обладают другие хвойные подложки.
• Подложка Isoplaat обладает самой высокой плотностью в своем классе: 270 кг/м³.
• Мокрый процесс производства плит обеспечивает лучшее склеивание волокон по сравнению с сухим процессом производства, где применяется «химия».
• В составе плит отсутствуют какие-либо химические связующие. Это значит, что при одинаковой плотности плит, в подложке Изоплат содержится древесного волокна на 5-10% больше.

Монтаж

Напольные плиты рекомендуется перед монтажом в течение одних суток выдержать в том помещении, где они будут использоваться. Это позволит влажности плит выровняться с влажностью окружающего воздуха. Для этого плиты распаковываются и устанавливаются вертикально, под них и между ними помещаются бруски, чтобы был обеспечен доступ воздуха к поверхности плит.

1. Плиты укладываются на основание пола в шахматном порядке. Во избежание совпадения зазоров между материалом покрытия и напольными плитами укладка производится под углом 45° по отношению к соединениям полового покрытия. Между стеной и плитами оставляются зазоры 5-10 мм на расширение, для обеспечения зазора можно использовать обрезки плит.

2. Между плитами следует оставить зазоры 1-2 мм. Для обеспечения лучшей устойчивости плит можно прикрепить их к основе несколькими каплями клея или скобой/гвоздем.

3. Лицевое покрытие пола укладывается на напольные плиты под углом 45°.

Фото монтажа под ламинат:

Успехов в монтаже!

Технические характеристики

Параметр	Значение	Единица измерения
Толщина	4 / 5 / 6 / 7	мм
Ширина	590	мм
Длина	850	мм
Площадь листа	0,5	м²
Листов в упаковке	14 / 18 / 18 / 14	шт
Площадь упаковки	7 / 9 / 9 / 7	м²
Плотность	270	кг/м³
Предел прочности на сжатие при 10%-ной линейной деформации	286	кПа
Коэффициент теплопроводности λи	0,069	Вт/м·K
Предел прочности при изгибе	— / 2,2 / — / —	МПа
Индекс уровня ударного шума, Ln,w*	-54	дБ
Поглощение ударного шума, /Δi*	-22	дБ

* согласно декларации производительности

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с вашим системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Сохранение субстратных предпочтений изолята в смешанных сообществах, выявленных с помощью профилирования белков рибосомных маркеров

Abstract

Оценка взаимосвязи структура-функция является центральной темой в микробной экологии. Однако степень сохранения метаболической активности изолята в сообществах остается неясной. Это связано с тем, что отслеживание динамики популяции и разделения субстрата в микробных сообществах остается технически сложной задачей. Здесь мы описываем применение профилирования белков рибосомных маркеров на основе масс-спектрометрии с подходом к исследованию стабильных изотопов, который позволяет проводить одновременный мониторинг динамики структуры сообщества и ассимиляции ресурсов в рамках сообщества синтетических почвенных бактерий, состоящего из пяти членов.Используя этот подход, мы обнаружили, что предпочтения изолятов в отношении глутамина и фенилаланина в значительной степени сохраняются в сообществе и могут быть предсказаны с помощью модели взвешенной суммы. Однако мониторинг временных рядов выявил значительную задержку включения фенилаланина двумя штаммами, а также усиленный рост Variovorax paradoxus , предположительно из-за межвидовых взаимодействий. Уникальная полезность этого подхода для временного исследования включения ресурсов и структуры сообщества позволяет расшифровать динамические взаимодействия, происходящие внутри сообщества.Распространение этого подхода на другие сообщества в условиях различных экологических возмущений необходимо для выявления универсальности сохранения предпочтений субстратов микробами.

Введение

Микробные сообщества частично сформированы динамическим пулом экзогенных метаболитов, возникающим в результате простой конкуренции за субстраты, симбиотических мутуализмов и сложных каскадов тропических цепей, которые имеют решающее значение для поддержания экосистем Земли ^1,2 . Тем не менее, мало что известно о сохранении использования микробного субстрата в контексте изолята и сообщества, потому что технически сложно измерить использование субстрата в смешанных сообществах.Ранее мы наблюдали корреляции между изолятами и метаболитами в окружающей среде, которые соответствовали паттернам метаболической активности изолята, предполагая некоторую степень сохранения использования субстрата ³ . Это сохранение метаболических ниш обеспечит мощный инструмент для связи структуры сообщества с общим метаболизмом на основе численности и активности составляющих его членов ^4,5 , например, для облегчения создания синтетических сообществ ⁶ .

Предыдущие исследования микробного метаболизма были в основном сосредоточены на использовании субстратов и предпочтениях отдельных изолятов, выращенных на одиночных или смешанных субстратах. ^7–9 . Среди ограниченных исследований, посвященных использованию ресурсов сообщества, были получены смешанные результаты относительно взаимосвязи между метаболической функцией смешанных сообществ и отдельными членами сообщества. Например, кинетика использования ресурсов 13 субстратов (аминокислот и глюкозы) для трехкомпонентного совместного культивирования была успешно предсказана простым суммированием профилей трех отдельных бактериальных штаммов, что позволяет предположить, что присутствие других видов не влияло. влияют на использование субстрата каждого отдельного вида ¹⁰ .Напротив, анализ моделей использования углерода с использованием 95 планшетов Biolog с субстратами показал, что скорость и степень окисления определенных, одиночных субстратов смешанным сообществом не были просто суммой тех, которые демонстрируют отдельные изоляты ¹¹ . Расшифровка факторов, лежащих в основе такой изменчивости, требует оценки различий в метаболическом поведении отдельных видов, растущих в одиночку, и в смеси, где возможны межвидовые взаимодействия. Это было сделано для растительных сообществ, и есть свидетельства того, что отдельные растения могут изменять использование ресурсов в присутствии конкурирующих соседей со значительными экологическими последствиями ¹² .Тем не менее, остается относительно неизвестным, существует ли такая пластичность в использовании ресурсов среди микробных сообществ.

В настоящее время существует несколько подходов для рутинной оценки численности сообществ, и относительный анализ сообществ с помощью секвенирования ампликона 16S рРНК является наиболее широко используемым, несмотря на известные экспериментальные ошибки. В последнее время были реализованы значительные улучшения для преодоления систематической ошибки экстракции и амплификации, а также сокращения времени обработки ^13,14 .

Важно отметить, что недавние исследования сочетали проточную цитометрию с секвенированием 16S рРНК, а также введение универсальных дополнительных стандартов, обычно E.coli 16S ампликоны до экстракции позволили одновременно определить абсолютную численность таксонов ^15,16 . Метагеномное секвенирование также широко используется для прямого анализа структуры микробиома ¹⁷ . В сочетании с зондированием ¹³ C-стабильных изотопов (SIP) ¹⁸ с использованием среды, содержащей ¹³ C-меченых субстратов и ультрацентрифугирования ДНК в градиенте плотности, этот подход можно использовать для отслеживания ассимиляции субстрата активными микробами (ДНК- SIP) ^19,20 .Точно так же метапротеомика является чрезвычайно мощным инструментом для измерения экспрессии in situ белка в микробных сообществах ^21–23 , а интеграция с SIP позволяет охарактеризовать ассимиляцию субстрата в микробных сообществах ^24–26 .

Альтернативной технологией, которая широко используется в клинической микробиологии для быстрой идентификации микробов, является времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF MS) ^27–30 .Традиционно этот подход включает сравнение масс-спектральных отпечатков белков с базой данных эталонных спектров для получения оценок достоверности идентификации штаммов с использованием алгоритма ³¹ на основе коэффициента сходства. Недавно исследования показали, что изменения в условиях роста и культивирования могут изменять масс-спектральные паттерны протеома, приводя к перекрытию между близкородственными таксонами ³² . Чтобы устранить предвзятость, приписываемую этому, особые усилия были сосредоточены на рибосомных белках, в отличие от всего протеома ^33,34 .Рибосомные белки, такие как рибосомная РНК (рРНК), присутствуют в большом количестве и могут использоваться в качестве таксон-специфичного диагностического маркера ³⁵ . Было показано, что профилирование рибосомных белков подходит для анализа простых консорциумов из двух-трех бактерий ^36,37 , что предполагает возможность использования SIP в сочетании с профилированием белка субъединицы рибосомы MALDI для быстрой оценки как структуры сообщества, так и метаболического включения в эти белки.

Здесь мы выдвинули гипотезу, что предпочтения изолята в отношении субстрата сохраняются в смешанном сообществе, и поэтому использование субстрата консорциумом должно быть точно предсказано с помощью модели взвешенной суммы с учетом изолята.Чтобы проверить это, мы использовали новый подход, сочетающий профилирование штамм-специфических рибосомных белков с зондированием стабильных изотопов с помощью MALDI-TOF MS для мониторинга использования глутамина и фенилаланина в сообществе синтетических бактерий, состоящем из пяти членов (SynCom; рис. 1). Строительство сообщества было основано на нашем предыдущем анализе трансляционно-активных микробов, присутствующих в образцах почвы из Центра полевых исследований Ок-Ридж (ORFRC) в Теннесси ³⁸ и разработке определенной среды, представляющей полярные маленькие молекулы, обнаруженные на этом участке ³⁹ .В целом, используя этот новый подход, мы определили, что предпочтения по использованию субстратов в целом сохраняются в пределах сообщества из пяти членов, одновременно обнаруживая положительные эффекты, приписываемые межвидовым взаимодействиям, на модели роста заместителей сообщества.

Рис. 1.

Рабочий процесс для нового подхода к SIP-протеомике смешанного сообщества. Схематическое изображение необходимых шагов для анализа: синтетическое бактериальное сообщество инкубируется с мечеными метаболитами.После профилирования рибосомных белков-маркеров на основе масс-спектрометрии численность сообщества выводится из относительной интенсивности пиков соответствующих маркерных белков. Одновременно с этим измеряется использование меченого субстрата отдельными микробами внутри сообщества путем оценки включения ¹³ C в маркерный белок.

Результаты

Выбор изолятов активного сообщества

Трансляционно-активные фракции микробных клеток, присутствующие в кернах почвы из ORFRC, были ранее идентифицированы в нашей лаборатории с использованием биортогональной неканонической аминокислотной метки (BONCAT) с проточной цитометрией и 16S рРНК секвенирование ³⁸ .Здесь сопоставление области V4 16S рРНК изолятов в нашей существующей коллекции штаммов с последовательностями Divisive Amplicon Denoising Algorithm (DADA) в таблицах операционных таксономических единиц (OTU) из экспериментов по проточной цитометрии BONCAT показало, что в среднем 86% Считывания последовательностей, полученные в активном сообществе, имели сходство последовательностей> 97% с культивированными изолятами из этого местоположения. Из этого пула микробных изолятов, связанных с экспериментами по проточной цитометрии BONCAT, были оценены двадцать репрезентативных бактериальных штаммов в среде, определяемой почвой (SDM) ³⁹ , для сборки SynComs, предназначенных для имитации активной популяции.Среда была сконструирована самостоятельно, чтобы обеспечить контролируемый пул питательных веществ, представляющий полярные небольшие молекулы, обнаруженные в ORFRC (компоненты таблицы 1-SDM). Концентрация сахаров и аминокислот была изменена, чтобы отразить соотношения, обычно встречающиеся в почвах (7: 1 соответственно). ^40–42 .

Шестнадцать изолятов со сравнимой скоростью роста были проверены на антагонистические эффекты во время совместного культивирования и анализа морфологии наложения чашек, что еще больше сузило пул штаммов до восьми совместимых изолятов.Из них были отобраны пять штаммов с низкими показателями сходства средней аминокислотной идентичности (AAI) (<75%) по протеому, а затем были отобраны уникальные белковые сигнатуры (описанные ниже) для последующего анализа SynCom: Brevundimonas sp . GW456-12-10-14-LB3, Microbacterium hominis FW305-3-2-15-F-LB2, Variovorax paradoxus GW458-12-9-14-LB2, Pedobacter soli GW460-11-11- 14-TSB4 и Cupriavidus necator GW460-LB6. Подсчет титров SynCom, культивированных в SDM (инокулированный при одинаковой OD), подтвердил, что все штаммы все еще присутствовали после 72 часов роста.Точки времени для анализа ранней экспоненциальной, среднеэкспоненциальной, стационарной и поздней стационарной фаз SynCom были определены в 3, 6, 18 и 42 часа соответственно (SI Рис. 1).

Профилирование экзометаболитов

Для определения субстратных предпочтений отдельных изолятов была проведена экзометаболомика временного ряда (анализ пулов экзогенных метаболитов, а также метаболический след ^43,44 ). В частности, монокультуры, выращенные в SDM, собирали через 3, 6, 18 и 42 часа для целевого экзометаболомического анализа с использованием хроматографии взаимодействия гидрофильных жидкостей в сочетании с квадрупольной времяпролетной тандемной масс-спектрометрией (HILIC-QTOF-MS / MS).Различные образцы истощения субстрата наблюдались среди пяти штаммов (рис. 2 и SI, рис. 2). В целом, наблюдались отдельные группы истощенных метаболитов, при этом сначала потреблялись аминокислоты, затем органические кислоты, а затем азотистые основания и сахара. Большинство аминокислот было равномерно истощено всеми штаммами, за исключением Brevundimonas sp ., В течение первых 6 часов роста (рис. 2). Несмотря на> 12-часовую лаг-фазу для V. paradoxus (SI Рис. 1), штамм оказался метаболически активным, на что указывает значительное потребление ряда метаболитов по сравнению с неинокулированной контрольной средой через 3 часа (Рис. ).Из доступных углеводов этот штамм также, по-видимому, избирательно предпочитал маннит в стационарной фазе, тогда как снижение содержания моносахарида (гексозы) наблюдалось в более поздние моменты времени для P. soli, C. necator и Brevundimonas sp. V. paradoxus потребляет пантотеновую, молочную, шикимовую и ванилиновую кислоты. В отличие от других штаммов, C. necator и P. soli истощили выбранную группу нуклеозидов и азотистых оснований.

Рис. 2.

Временные графики истощения метаболитов монокультур и SynCom.Динамика метаболитов (52 метаболита отображаются как средняя высота пика, нормализованная к максимальной интенсивности в каждом ряду) наблюдалась в экстрактах экзометаболитов из культур, выращенных в среде, определенной в почве. Данные представлены как среднее значение повторов (n = 3). Штаммы имеют следующие сокращения: Mh-M. hominis, Cn-C. necator, Bs-Brevundimonas sp ., Ps-P. soli, Вп-В. paradoxus , Sc — SynCom.

Выбор и проверка штамм-специфичных рибосомных маркерных белков

База данных SynCom-специфических протеомов была построена на основе спектров каждого изолята в четырех выбранных фазах роста, а также в трех различных определенных композициях сред (описанных в методах), чтобы гарантировать устойчивое покрытие репрезентативного протеома.Чтобы оценить жизнеспособность и воспроизводимость штаммов-специфических пиков как потенциальных рибосомных маркерных белков, составные сводные спектры были составлены для всех биологических повторов. Спектральные пики, присутствующие во всех условиях, были выбраны путем ручного сопоставления суммарных спектров. По этим пикам потенциальные белки-маркеры рибосом были идентифицированы в результате дифференциального анализа между штаммами (значение p <0,05, таблица 1 - потенциальные маркерные белки). Кроме того, выбор репрезентативных классов пиков (список потенциальных рибосомных маркерных белков) с вариабельностью внутри изолята по интенсивности <10% выявил уникальный белок-кандидат-маркер для каждого изолята (рис. 3а).

Рис. 3.

Проверка и отслеживание роста с помощью выбранных рибосомных маркерных белков. a) Типичные белковые профили для изолятов SynCom; выбранные маркерные белки обозначены цветными маркерами. b) Подтверждение измерения относительной численности членов сообщества с использованием штамм-специфичных маркерных белков. Доля фракционного содержания штаммов для каждого изолята оценивалась по среднему содержанию маркерного белка в синтетической смеси изолятов при различных концентрациях Brevundimonas sp . c) Относительная численность для каждого штамма в SynCom, отображаемая в течение 42-часового периода роста d) Нормализованная численность по биомассе в течение 42-часового периода роста; ось ординат представляет относительный вклад каждого штамма по отношению к общему OD смешанного сообщества (SI, рис. 1) в каждый момент времени. Планки ошибок отображаются как стандартное отклонение среднего (n = 4).

Чтобы подтвердить полезность этих маркеров, кодирующих определенные белки рибосомных субъединиц, как описано в методах (таблица 1 — потенциальные маркерные белки), для отслеживания отдельных бактериальных изолятов внутри сообщества, мы проанализировали смешанные образцы сообщества с известными концентрациями.В частности, варьируя процентный относительный состав Brevundimonas sp . от 2% до 80%, мы подтвердили, что численность штаммов может быть надежно отслежена с ошибкой 5% с использованием выбранных белков-маркеров (рис. 3b). Чтобы убедиться, что это верно для всех изолятов, для отдельных штаммов были построены стандартные кривые. Все белки-маркеры рибосом показали сильную корреляцию между их экспериментальным и номинальным процентным составом, о чем свидетельствуют их значения R-квадрата, которые были выше 0.93 (SI Рис 3).

Отслеживание состава сообщества

Поскольку нормализованные пиковые интенсивности выбранных белков-маркеров рибосом положительно коррелировали с соответствующей численностью бактерий, мы использовали их для отслеживания динамики сообщества пяти бактериальных изолятов в смешанном SynCom (каждый штамм имел равные исходные относительные количества и общая начальная плотность клеток SynCom равна плотности монокультур) в течение периода роста 42 часа в SDM (рис. 3c, 3d). Чтобы напрямую оценить относительную численность каждого изолята в SynCom, из сообщества брали пробы в различные моменты времени и сразу же извлекали для скрининга рибосомных маркерных белков.Относительные соотношения численности были подтверждены с помощью трехкратного подсчета титров на чашках для серийных разведений от 10 ⁴ до 10 ⁶ КОЕ / мл (подсчет титров в таблице 1 SI). Как видно из графика состава сообщества (рис. 3c), C. necator доминировали в сообществе на ранней стадии (до 6 часов), тогда как P. soli, M. hominis и V. paradoxus стали доминирующими. доминирует к 42 час. В то время как V. paradoxus не показывал никакого роста до 12 часов в монокультуре (SI Рис. 1), значительный рост наблюдался в SynCom уже через 6 часов, что предполагает полезные взаимодействия внутри сообщества.

Моделирование использования ресурсов в монокультурах и сообществах

Поскольку структура сообщества предполагает возможные межвидовые взаимодействия, мы хотели проверить сохранение использования субстрата в смешанном сообществе по сравнению с таковым в монокультуре. Для этого мы специально сосредоточились на двух аминокислотах, глутамине и фенилаланине; оба обычно обнаруживаются в почвенной воде и могут служить источниками углерода и азота для почвенных микробов ^3,39,45 . Эти два субстрата показали различные паттерны истощения в профилях экзометаболита пятью монокультурами (Рис. 2 и SI Рис. 2).Данные об истощении метаболитов с временным разрешением (рис. 2) были подогнаны к ранее опубликованной модели Behrends et al. ⁴⁶ . В частности, кинетика истощения отдельного субстрата из смеси субстратов изолятом в ходе роста в условиях периодического культивирования может быть описана сигмоидной функцией (методы, уравнение 1). Мы обнаружили, что для каждой из пяти бактериальных монокультуры истощение в них глутамина и фенилаланина соответствовало модели Берендса со средним значением R-квадрата 0.998 (SI Рис. 4, 5 и Таблица 1 — оценочные параметры моделирования). Затем измеренные данные истощения и подобранная кинетика истощения вычитались из начальных концентраций субстратов в среде и преобразовывались в данные об использовании и моделировали кинетику использования для каждой монокультуры (рис. 4a). Два параметра, описывающие свойства использования субстрата — T ₅₀ (время, когда была использована половина доступного субстрата) и ширина (продолжительность, когда субстрат используется с максимальной скоростью) — значительно различались между пятью бактериями (рис. 4b, SI рис. 6), демонстрируя различия в предпочтениях использования субстрата. M. hominis истощил фенилаланин быстрее всего, с наименьшим значением T ₅₀ (2,81 ± 0,07 ч), за ним следует C. necator (3,39 ± 0,14 ч), V. paradoxus (4,35 ± 0,13 ч), и, наконец, P. soli (8,22 ± 0,27 ч) и Brevundimonas sp . (8,61 ± 0,30 ч; рис. 4б, справа). Что касается глутамина, M. hominis (2,17 ± 0,16 ч) и V. paradoxus (2,10 ± 0,04 ч) истощили глютамин быстрее, чем C. necator (2,79 ± 0,01 ч).01 ч) и P. soli (2,94 ± 0,03 ч), с Brevundimonas sp . самый медленный (10,86 ± 0,37 ч; рис. 4б, слева). По мере увеличения значений T ₅₀ временной интервал вокруг максимальной скорости (ширины) поглощения также увеличивался (SI Рис. 6).

Рис. 4.

Моделирование и измеренное использование субстрата в монокультурах и SynCom. a) Для каждого вида бактерий, выращенных в монокультуре, их данные об использовании с временным разрешением (цветные маркеры) глутамина (слева) и фенилаланина (справа) были подогнаны под ранее опубликованную модель Behrends et al.(2009) с использованием нелинейного метода наименьших квадратов (SI рис. 4, 5). Пять смоделированных кинетик использования монокультуры (цветные линии) были суммированы и взвешены по исходной относительной численности каждого вида в SynCom для получения прогнозируемой общей кривой использования пятичленного SynCom (SynCom_Predicted: темно-серая линия). Светло-серые кружки представляют собой измеренное использование подложки SynCom. Планки погрешностей (для пяти монокультур и SynCom) и затенение (для SynCom) представляют собой стандартную ошибку среднего (n = 3). b) Расчетные значения T ₅₀ для использования глутамина (слева) и фенилаланина (справа) для каждой монокультуры.Буквы обозначают значительные различия ( p <0,05) между видами для одного и того же субстрата с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с апостериорным тестом Тьюки HSD (n = 3, за исключением глутамина, n = 2 для Brevundimonas sp ., C . necator и P. soli ; SI Рис. 4, 5, Таблица 1). c) Включение субстратов, меченных ¹³ C-глутамином (слева) и ¹³ C-фенилаланином (справа), в штамм-специфичные рибосомные маркерные белки в смешанном сообществе после 6 часов роста.Относительная численность в сообществе выводится по оси ординат на рис. 3c через 6 часов, тогда как фактор маркировки ¹³ C является мерой относительного сдвига массы. Планки погрешностей представлены как стандартное отклонение среднего (n = 3).

Рис. 5.

Сравнительное использование ¹³ C-фенилаланина. a) Инкрементное использование ¹³ C-фенилаланина штаммами в монокультурах и SynCom, определяемое рибосомным маркером белка SIP. Значительные отличия от однофакторного дисперсионного анализа при использовании монокультуры и SynCom обозначены ( p <0.05), где планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку (n = 3). b) График использования фенилаланина монокультурами через 6 часов, как определено экзометаболомикой (рис. 2) и кумулятивным ¹³ C-обогащением рибосомным маркером белка. c) Сравнительный график общего использования ¹³ C-фенилаланина отдельными штаммами в монокультурах и SynCom через 6 часов. Планки погрешностей представлены как стандартное отклонение среднего (n = 3).

Для прогнозирования кинетики использования пятичленного SynCom кривые использования монокультуры были суммированы и взвешены для начальной относительной численности каждого вида в сообществе (рис. 3c).Прогнозы моделирования затем сравнивались с измеренной SynCom динамикой использования субстрата, определенной с помощью профилирования экзометаболомики (рис. 2). Мы обнаружили разные тенденции для двух подложек (рис. 4а). Прогнозируемое использование фенилаланина в SynCom хорошо согласуется с измерениями (R ² > 0,99, p = 0,0001; рис. 4a, справа). Однако использование глутамина, измеренное в SynCom, отклонилось от прогноза модели (R ² = 0,78, p = 0,047; рис. 4a, слева) и показало почти полное истощение через 6 часов, тогда как модель предсказывала только 82% использования в этот момент времени.

Отслеживание включения ресурса в белки-маркеры рибосом

Для дальнейшей оценки того, как субстрат был распределен между его членами, мы использовали зондирование стабильных изотопов в сочетании с профилированием белков-маркеров рибосом. Предыдущие исследования были сосредоточены на анализе конечных точек для определения метаболического потока путем измерения изменения включения изотопов ⁴⁷ . Здесь мы выбрали три изотопно-меченых субстрата, ¹³ C-глутамин, ¹³ C-фенилаланин и ¹³ C-глюкозу, чтобы отслеживать относительное включение субстрата каждым членом в SynCom с течением времени.Для этого пять бактериальных штаммов выращивали в SDM с заменой субстрата ¹² C на изотополог, меченный ¹³ C, как в монокультуре, так и в смешанном сообществе из пяти членов. Включение этих меченых субстратов в белок рибосомный маркер оценивали путем аннотирования среднего сдвига массы белка в результате обогащения тяжелыми изотопами ⁴⁸ .

Использование для последующих исследований по обогащению было определено путем сравнения наблюдаемой массы с теоретической массой для каждого соответствующего маркерного белка.Мы оценили верхнюю границу маркировки растущих монокультур в ¹³ C-глюкозе, предпочтительном бактериальном источнике углерода (SI, рис. 7). Для глутамина и фенилаланина различное включение ¹³ C в белки-маркеры рибосом наблюдали различными штаммами в SynCom через 6 часов (рис. 4c). В частности, в среде, меченной С-глутамином ¹³ , Brevundimonas sp . не показали наблюдаемого сдвига массы (в белке-маркере, идентифицирующем штамм), но все маркеры для других четырех членов SynCom показали значительное обогащение; это было ожидаемо, учитывая задержку утилизации глутамина Brevundimonas sp .в монокультуре (Рис. 2 и SI Рис. 2).

Интересно, что анализ возрастающего использования ¹³ C-фенилаланина в каждом временном диапазоне выявил резкие временные сдвиги в моделях использования между SynCom и монокультурами (рис. 5a). Мы наблюдали, что как в монокультуре, так и в консорциуме M. hominis быстро включала фенилаланин в первые 3 часа, тогда как другие штаммы демонстрировали замедленное потребление субстрата в SynCom. В частности, P. soli и Brevundimonas sp .мало или совсем не содержал ¹³ C в SynCom по отношению к их уровням включения в монокультуры в течение первых 3 часов. Однако они оба показали повышенное включение в течение 3-6 часов. Также наблюдалась значительная разница для C. necator в течение периода 6-18 часов. В монокультуре этот штамм, по-видимому, включал большее количество фенилаланина в течение периода 6-18 часов, чем в SynCom, что позволяет предположить, что потребление в SynCom перешло на другие субстраты.

Обсуждение

Использование ресурсов микробными видами с различными потребностями в питании важно для структурирования микробных сообществ и в конечном итоге определяет общую метаболическую активность сообщества ^49,50 . В этом исследовании мы изучили сохранение предпочтения микробных субстратов глутамину и фенилаланину в монокультуре по сравнению с SynCom. Это было сделано с использованием профилирования штаммов-специфических рибосомных маркерных белков в сочетании с зондированием стабильных изотопов для одновременного измерения относительной численности штаммов и включения субстрата в пятичленный бактериальный SynCom.

Для монокультур наблюдались различные предпочтения субстрата (Рис. 2 и Рис. 4). В частности, для всех пяти изолятов, за исключением Brevundimonas sp ., Глутамин был предпочтительнее фенилаланина, на что указывают меньшие значения T ₅₀ , отражающие более раннее истощение во время роста. Аналогичные тенденции были зарегистрированы ранее для других бактерий, в частности двух псевдомонад и одной бациллы, выделенных из подземных вод ¹⁰ . Морская бактерия Pseudoalteromonas haloplanktis также использовала глутамин в качестве предпочтительного источника аминокислот с истощением> 95% после 4.5 часов роста, в то время как истощение фенилаланина было медленным в течение первых 3 часов роста, прежде чем его концентрация снизилась до пренебрежимо малой к ~ 7,5 часам. ⁵¹ . Геномный анализ свидетельствует о задержке использования глутамина Brevundimonas sp . по сравнению с другими штаммами может быть связано с отсутствием гена, кодирующего глутаминазу (EC 3.5.1.2) ⁵² .

Чтобы оценить, сохраняются ли предпочтения изолята в субстрате в смешанном сообществе, мы применили модель взвешенной суммы для прогнозирования использования субстрата в сообществе.Экологическая теория предполагает, что при отсутствии межвидовых взаимодействий функционирование смешанного сообщества должно равняться совокупному выходу составляющих его компонентов; отклонения от этого означают межвидовые взаимодействия ^53,54 . Общее использование ресурсов пятичленным SynCom было спрогнозировано на основе кинетики использования каждого отдельного изолята с использованием модели суммирования, взвешенной по исходной относительной численности каждого члена ⁵⁴ .

Для фенилаланина кинетика использования SynCom была точно согласована с использованием модели ресурсов взвешенной суммы, предполагая, что межвидовое взаимодействие не влияет на использование фенилаланина каждым видом в SynCom.Анализ включения ¹³ C-фенилаланина в рибосомные маркерные белки для каждого члена SynCom также подтвердил этот вывод. В частности, наблюдалась сильная корреляция между использованием фенилаланина, количественно определенным с помощью экзометаболомики изолята, и фактором маркировки ¹³ C для каждого штамм-специфичного маркерного белка после 6 часов роста в среде, меченной ¹³ C-фенилаланином (рис. 5b). Более того, степень включения фенилаланина пятью бактериями в SynCom была пропорциональна таковой в монокультурах в течение первых 6 часов (рис. 5c), что указывает на то, что поведение каждого штамма по отношению к фенилаланину было в основном консервативным в смешанном сообществе.Это интересно, учитывая, что, вероятно, существует множество смешанных процессов, возникающих в результате совместного метаболизма и распределения субстрата по протеому, происходящих одновременно. Одна из вероятных причин, по которой рибосомный маркерный белок-SIP служил точным представителем для использования субстрата в эти ранние временные точки, может быть отчасти из-за быстрого обмена рибосомных белков у прокариот ⁵⁵ .

Для глутамина прогнозируемое использование было медленнее, чем фактическое общее использование сообщества, измеренное с помощью профилирования экзометаболита.Это отклонение может быть связано с межвидовой конкуренцией за этот предпочтительный источник аминокислот (что приводит к быстрому снижению концентрации) или использованием альтернативных субстратов, продуцируемых членами сообщества ^56,57 . Будущий анализ среды, израсходованной на ¹³ C, может дать полезную информацию при изучении скорости истощения метаболитов в SynCom. В монокультуре четыре штамма истощили почти весь глутамин (> 99%) в течение первых 6 часов со средним T ₅₀ , равным 2.5 часов (рис. 2, 4а, 4б). В частности, с наименьшим Т ₅₀ среди пяти видов, V. paradoxus истощил глютамин в течение 3 часов, задолго до того, как был заметный рост (SI Рис. Это говорит о том, что этот штамм имел тенденцию преимущественно накапливать глутамин без репликации. Ранее сообщалось о подобных результатах; например, Bacillus cereus истощила глюкозу на ранней стадии роста, вероятно, из-за значительной задержки преобразования субстрата во время репликации или быстрого преобразования глюкозы в другие соединения, такие как гликоген ¹⁰ .При изучении структуры сообщества, измеренной с использованием уникальных рибосомных маркерных белков с течением времени, мы наблюдали более значительный рост для V. paradoxus в SynCom, чем в монокультуре, через 6 часов (рис. 3c, 3d), что указывает на его конкурентное преимущество за счет межвидовых взаимодействий. ⁵⁰ . Взятые вместе, преимущественное накопление глютамина V. paradoxus и его повышенный рост в SynCom, возможно, привели к более быстрому использованию глутамина в сообществе, чем предсказывается моделью.

Эти результаты имеют значение для того, как использование ресурсов и конкуренция могут структурировать бактериальные сообщества. Теория ниши утверждает, что одним из механизмов стабильного сосуществования видов является усиление дифференциации ниши за счет различных моделей использования ресурсов ^58,59 . В нашей предыдущей работе сообщалось о небольшом перекрытии ниш экзометаболитов среди симпатрических микробов в двух почвенных средах ⁸ . В этой работе, вероятно, из-за того, что наша почвенная среда содержит относительно небольшое количество обычных бактериальных субстратов, между пятью видами наблюдалось большее совпадение в использовании субстрата.Соревнуясь за перекрывающиеся ресурсы, мы обнаружили, что предпочтение использования изолированного субстрата в основном сохраняется, и определили относительное разделение использования внутри сообщества. Это согласуется с современной теорией ресурсной конкуренции, согласно которой характеристики использования ресурсов монокультурой могут предсказать конкуренцию за ресурсы в смешанных культурах ⁶⁰ . Тем не менее, это не исключало наличия метаболических взаимодействий между видами и воздействия на сообщество. Для фенилаланина соответствие R-квадрат нашей модели взвешенной суммы для прогнозирования использования сообщества было> 0.99, но мы все же наблюдали различия во временном использовании субстрата по сравнению с монокультурой. Что касается глутамина, с более высоким уровнем использования, совпадающим с большинством членов сообщества, общее использование было не просто агрегированным термином, но также зависело от конкурентных способностей составляющих видов в рамках сообщества, установив ⁶¹ , как упоминалось выше для В. Парадокс . Мы предполагаем, что динамическая метаболическая адаптация для максимизации относительной приспособленности в условиях конкуренции ⁶² и / или стимулирующие взаимодействия, такие как совместный метаболизм продуктов жизнедеятельности другими видами ⁵⁶ , могли улучшить конкурентное преимущество определенных видов в сообществе.Дальнейшая работа, объединяющая наш подход к рибосомному маркерному белку-SIP с интегрированным моделированием структуры сообщества и использования субстрата, позволит более механистически понять такие взаимодействия.

В целом, мы обнаружили, что адаптация профилирования белков, которая широко используется в клинических приложениях ^30,63 и, насколько нам известно, не использовалась для экологических исследований, позволяет быстро профилировать структуру сообщества и разделение ресурсов в рамках SynCom.Эта расширенная возможность для выполнения параллельного анализа ¹² C-media для профилирования численности сообщества и ¹³ C-media для разделения ресурсов дает дополнительные преимущества по сравнению с традиционно используемым секвенированием ампликона 16S рРНК. Однако, чтобы облегчить более широкое применение этого подхода для исследования ресурсных взаимодействий в микробных сообществах, необходимо рассмотреть несколько соображений. Во-первых, выбор уникальных белков-маркеров рибосом для каждого микроба в сообществе требует предварительного скрининга или создания базы данных эталонных белков-маркеров рибосом, и маловероятно, что этот подход может быть эффективно применен к сообществам, состоящим из более чем примерно 30 штаммов.Во-вторых, сложность, присущая учету первичных и вторичных пользователей, а также включение метки в неотслеживаемые части протеома, добавляют дополнительную сложность к предполагаемой степени наличия метки. Чтобы ограничить последствия этого, время инкубации было относительно коротким, но это отрицательно привело к некоторому расширению пиков из-за одновременного проведения обширной степени мечения. Хотя использование интактных белков, в отличие от пептидов, действительно сворачивает измерения распределения изотопной оболочки ²⁶ , быстрого и надежного характера этого подхода было достаточно для определения роли конкуренции ресурсов и перекрестного питания в структурировании микробных сообществ.Однако мы видим значительные возможности для интеграции этого подхода с полной метапротеомикой ^23,24 , чтобы обеспечить более полное понимание деятельности сообщества. В частности, высокая производительность профилирования рибосомных белков позволяет исследовать большие экспериментальные пространства (например, субстраты, условия окружающей среды и т. Д.), Которые можно исследовать очень подробно, используя более медленные, но более полные метапротеомные методы.

В заключение, используя стабильное изотопное зондирование штамм-специфических рибосомных белков, мы обнаружили, что предпочтения изолята в отношении субстрата глутамина и аланина в значительной степени сохранялись в смешанных сообществах, и смогли предсказать использование субстрата для смешанного сообщества из пяти бактерий из культур изолята.Вместе эта интегрированная структура моделирования и тестирования обеспечивает платформу для проектирования и совершенствования синтетических сообществ на основе знаний о предпочтениях субстратов и анализа маркеров рибосомных белков. Мы ожидаем, что это станет важным новым инструментом для получения информации о поглощении и обмене метаболитов в лабораторных консорциумах, и при широком применении для различных организмов может определить степень сохранения микробного субстрата изолированно по сравнению с консорциумами.

Материалы и методы

Chemicals

Глюкоза (CAS 50-99-7) была от Amresco (Солон, Огайо). ¹³ C-глутамин (C5-99%), ¹³ CL-фенилаланин (кольцо, C6-99%), ¹³ C-глюкоза (C6-99%) и смеси аминокислот водорослей были от Cambridge Isotopes Лаборатория, Inc. (Тьюксбери, Массачусетс). Метанол и вода для ЖХМС-чистоты были получены от J.T. Бейкер (Avantor Performance Materials, Center Valley, Пенсильвания). Все остальные стандарты, наборы аминокислот и метаболиты были от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).

Бактериальные изоляты

Коллекция штаммов бактериальных изолятов, выделенных в Центре полевых исследований Ок-Риджа в Университете им.С. Министерство энергетики Окриджская национальная лаборатория (Ок-Ридж, Теннесси) была предоставлена ​​Роми Чакраборти и Адамом Дойчбауэром (Национальная лаборатория Лоуренса Беркли, Беркли, Калифорния). Изоляты были восстановлены из запасов глицерина на среде SDM для использования в культуральных экспериментах. Лабораторные изоляты с аналогичными темпами роста были отобраны для построения модели SynCom на основе наиболее близкого совпадения 16S с наиболее распространенными последовательностями, идентифицированными в активной фракции почв Окриджа с использованием маркировки BONCAT ³⁸ .

Media Construction

Oak Ridge Field Research Center был построен, как описано ранее, с небольшими изменениями. ³⁹ . Базовая среда содержала те же 46 метаболитов, которые наблюдались в экспериментах по количественному определению метаболитов в почве с полевого участка ORFRC (компоненты SI Table 1-SDM), с измененными концентрациями, отражающими соотношение сахар: аминокислоты, обычно наблюдаемое в образцах окружающей среды ^{40– 42} . К основной среде добавляли дополнительную среду метаболита, содержащую 14 незаменимых органических кислот по 5 мкМ каждая, а также витамин Вульфа и минеральные растворы Вульфа в концентрации 1Х. ⁶⁴ .Рост 20 активных репрезентативных полевых изолятов BONCAT подвергали скринингу в SDM при 30 ° C в течение 42 часов, чтобы выбрать штаммы-кандидаты с аналогичными темпами роста для создания пятичленного SynCom. Чашки с агаром для анализов твердой культуры готовили с 1,5% агаром.

Скрининг фенотипа совместного культивирования

Для скрининга совместимости изолятов был проведен посев бактерий со штамповкой микрочипов. Вкратце, ночные культуры наносили тонким слоем на чашки с агаром SDM и давали высохнуть на воздухе перед тем, как по отдельности депонировали два микролитра чистых изолятов методом наложения.Культуры наносили пятнами на расстоянии 10 мм друг от друга в микроматрице 6 x 6 на квадратной чашке Петри, чтобы гарантировать пространственное разделение культур. Очищающие зоны и морфологию роста наблюдали после 42-часового инкубационного периода при 30 ° C для определения тенденций взаимодействия.

Исследования роста и экстракции изолятов

Монокультуры штаммов SynCom были восстановлены из замороженных запасов (30% глицерина) в SDM при 30 ° C в течение 18 часов. После инкубации культуры центрифугировали при 3800 x g в течение 5 минут и промывали PBS (1x, pH 7.2). Клетки ресуспендировали в свежем SDM, и OD ₆₀₀ доводили до 0,05 ± 0,025 для инициализации исследований роста. Показания OD ₆₀₀ снимали каждые 15 минут при орбитальном перемешивании при 30 ° C в течение 72 часов для точного определения плотности клеток и лаг-фазы с использованием многорежимного ридера для микропланшетов на основе монохроматора Biotek Synergy h2m. Рост определяли как увеличение OD более чем на 0,05 от начальной точки времени после вычитания контроля среды. Аликвоты удаляли через 3, 6, 18 и 42 часа для последующего процессинга экзометаболомных и рибосомных маркерных белков.Для профилирования экзометаболита 200 мкл бактериальной культуры центрифугировали при 3800 x g в течение 5 мин в трех повторностях с последующей фильтрацией супернатанта через спин-фильтр из ПВДФ 0,22 мкм (MilliporeSigma, Берлингтон, Массачусетс) для удаления остатков клеток, а затем лиофилизировали. Высушенные образцы ресуспендировали в 150 мкл метанола класса LCMS, с добавлением меченой смеси внутреннего стандарта, состоящей из аминокислот, нуклеозидов, азотистых оснований и сахаров, в течение указанного временного окна, и хранили для анализа LCMS (как описано ниже).Параллельные аликвоты культур нормализовали до конечной OD ₆₀₀ 0,5 перед гашением для определения профиля рибосомного белка. Для гашения и последующего анализа MALDI-TOF MS клетки собирали центрифугированием при охлаждении (10 ° C) OD-нормализованных культур при 3800 x g в течение 5 минут с последующей промывкой PBS. Осадки клеток ресуспендировали в 50 мкл раствора 70% этанол / 1% TFA с 30 мг / мл тимола, добавленных перед инкубацией при 52 ° C в течение 10 минут, чтобы одновременно остановить метаболизм и извлечь белки.После нагревания проницаемые клетки хранили при -20 ° C для анализа MALDI-TOF MS (как описано ниже). Чашки с питательным агаром использовали для серийных анализов титра колоний для подтверждения относительной численности видов. Все штаммы имели уникальную морфологию колоний в описанных условиях роста, что позволяло проводить точный подсчет на чашках.

Выбор и проверка маркеров рибосомных белков

База данных была построена с использованием составных суммарных спектров для каждого из штаммов в SynCom для отбора белков-маркеров рибосом.Вкратце, каждый изолят выращивали в трех минимальных средах (SDM, минимальная среда Вульфа и базальная среда 14AA; SI, таблица 1), и аликвоты удаляли в различные моменты времени для последующей обработки, чтобы гарантировать, что выбранные белки-маркеры рибосом не являются фазами или метаболитами. зависит от состава; эти среды и временные условия отражаются как биологические копии для сравнений обработки данных. Необработанные спектры (n = 36; на изолят) были импортированы и обработаны, как описано ниже в анализе данных, для выбора пиков с отношением сигнал / шум более 10.Технические и биологические реплики были объединены в составные спектры с использованием фильтра подобия 95 и 75% соответственно. Многомерное масштабирование (MDS) использовалось для визуализации спектрального сходства и обеспечения наличия различных групп изолятов. Двусторонняя кластеризация была выполнена на матрице данных, что позволило определить потенциальные рибосомные маркерные белки на уровне штамма; классы пиков были выбраны со значением p <0,05 (таблица 1 SI - потенциальные рибосомные маркерные белки).Определенные белки-маркеры рибосом подвергали скринингу по двадцати неизвестным спектрам, чтобы гарантировать правильную идентификацию штамма (оценка сходства> 95%). Для определения идентичности белковых маркеров сборки генома подвергали in silico экстракции нуклеотидных последовательностей с использованием tBLASTn в KBASE перед предсказанием моноизотопной молекулярной массы с использованием инструмента параметров белка ExPASy ^52,66 . Наиболее распространенные посттрансляционные модификации, в частности потеря N-концевого метионина, фосфорилирование и метилирование, были приняты во внимание для обеспечения точности прогнозов моноизотопной массы.

Изобилие сообществ и использование ресурсов

Смешанные сообщества были инокулированы аналогично исследованиям роста. Вкратце, изоляты были восстановлены из запасов морозильной камеры и промыты после инкубации в течение ночи в SDM. Для исследований численности и использования изоляты равным образом смешивали (нормализованная OD) со свежей средой и инкубировали в течение 3, 6, 18 и 42 часов до метаболического тушения. В образцы белка добавляли убиквитин (Sigma-Aldrich BioUltra, 5 нмоль), небольшую субъединицу белка, нативного для эукариот, который был добавлен перед гашением в качестве внутреннего стандарта для учета инструментальной дисперсии между образцами.Измерения относительной численности были выполнены путем сравнения относительных соотношений пиков маркерных белков в смешанном сообществе в различные моменты времени. Исследования по изотопному обогащению были выполнены с использованием идентичных компонентов среды с заменой одного ¹³ C-меченого субстрата на его ¹² C-аналог. Три представляющих интерес метаболита, ¹³ C-глутамин (C5-99%), ¹³ CL-фенилаланин (кольцо, C6-99%), ¹³ C-глюкоза (C6-99%), были проверены на продолжительность фазы роста для каждого отдельного изолята, чтобы гарантировать включение в рибосомный маркерный белок, было возможным.

ЖХМС-анализ

Экстракты экзометаболита были разделены хроматографически с помощью гидрофильной жидкостной хроматографии взаимодействия (HILIC) на системе ВЭЖХ Agilent серии 1290, оснащенной InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, 2,1 × 50 мм, 2,7 мкм, колонка с покрытием из ПЭЭК (Agilent 679775-924) с 7-минутным градиентом. Поток жидкости направляли на квадрупольный времяпролетный тандемный масс-спектрометр Agilent 6550 (Q-TOF MS / MS), работающий с положительной и отрицательной полярностью для анализа. Все параметры и расписания приведены в таблице SI 1-Условия эксплуатации LCMS.

MALDI-TOF MS-анализ

Каждую аликвоту смешивали с синапиновой кислотой (10 мг / мл в 30% ацетонитриле / 1% TFA) в соотношении 5: 1 (матрица: образец) перед нанесением одного микролитра в трех экземплярах пятен на предметное стекло, покрытое ITO. Конечный раствор наносили в трех экземплярах в виде пятен размером один микролитр. Технические реплики спектров были независимо получены с использованием масс-спектрометра Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF (Bruker Daltonics; Биллерика, Массачусетс), оснащенного лазером Nd: YAG с длиной волны 337 нм. Спектры были получены вручную в виде композитов на 500 выстрелов в положительном линейном режиме в диапазоне масс от 3 до 25 кДа с использованием программного обеспечения FlexControl (версия 4.0; Bruker Daltonics; Биллерика, Массачусетс). Калибровку прибора проводили с использованием смеси Bruker Protein Calibration Standard I в соответствии со спецификациями производителя.

Анализ и моделирование данных

Файлы метаболомики были преобразованы в формат mzML (ProteoWizard MSConvert, Пало-Альто, Калифорния) ⁶⁷ и проанализированы с помощью Metabolite Atlas (https://github.com/biorack/metatlas) в сочетании с Python для построение хроматограмм экстрагированных ионов (EIC), соответствующих метаболитам, содержащимся в SDM и нашей собственной библиотеке стандартов ^68,69 .Аутентичные стандарты были дополнительно использованы для подтверждения назначений на основе точной массы менее 15 ppm, времени удерживания в пределах 0,1 мин от прогнозируемого, а также сопоставления MS / MS ионов основных фрагментов (идентификация метаболитов в таблице 1 SI). Внутренние стандарты и смеси для контроля качества оценивались, чтобы гарантировать отсутствие дрейфа времени удерживания от образца к образцу или снижения интенсивности; все метаболиты, которые элюировались до фронта растворителя ( t _o = 0,2 мин), были исключены из анализа.Таблицы высоты пиков были обработаны и использованы для создания тепловых карт для прямого сравнения использования метаболитов. Статистический анализ проводился с использованием Microsoft Excel и R v3.6.1 на основе p-показателя <0,05. Необработанные данные и обработанные результаты были депонированы на портале генома Объединенного института генома под идентификатором проекта: 1280078 (https://genome.jgi.doe.gov/portal/202ics_FD/202ics_FD.info.html).

Для моделирования истощения глютамина и фенилаланина каждым отдельным видом, выращиваемым в монокультуре, данные об относительном содержании субстрата ( s ), измеренные метаболомикой во времени ( t ), были подогнаны к модели Берендса ⁴⁶ с использованием нелинейных наименьших квадратов. в R v3.6.1: где a — амплитуда, рассчитанная как разница между начальным и самым низким уровнями содержания субстрата; o — смещение, определяемое как наименьшее содержание субстрата; T ₅₀ — период полураспада, определяющий время при половинной амплитуде; и w — ширина, определяющая временное окно, когда показатель степени e изменяется от 1 до -1, грубо показывая «окно поглощения», когда субстрат истощается с максимальной скоростью.

Сырые масс-спектры были экспортированы в виде файлов ASCII с помощью программного обеспечения FlexAnalysis (версия 4.0; Bruker Daltonics; Billerica, MA) и импортированы в программное обеспечение BioNumerics (версия 7.6, Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Бельгия) для выбора белков рибосомных маркеров и оценка. Необработанные масс-спектры сглаживали с помощью окна Кайзера, равного 20 точкам, вычитание базовой линии выполняли с использованием алгоритма вращающегося диска размером 75 точек, шум вычисляли с использованием непрерывного вейвлет-преобразования (CWT) с отсечкой s / n, равной 10.Иерархическая классификация проводилась с использованием рангов Спирмена и евклидовых расстояний. Для исследований по обогащению ¹³ C обогащение тяжелыми изотопами измеряли путем сравнения наблюдаемого увеличения массы с прогнозируемым номинальным увеличением массы однородно меченого белка. Временное использование рассчитывалось следующим образом для определения использования меченого субстрата по отношению к немеченым компонентам среды:

Вклад авторов

NRS и TRN разработали исследование и разработали эксперименты.Рукопись написали NRS и YW. NRS провела эксперименты. NRS и SMK проанализировали данные метаболомики. Фигуры разработали NRS и YW. BPB и YW разработали код для моделирования и интерпретации данных. РЦ выделили и секвенировали все штаммы, использованные в исследовании. Все соавторы прокомментировали план экспериментов, анализ данных и черновик рукописи .

Дополнительная информация

SI Таблица 1: Дополнительный файл Excel (среда, метаболиты, штаммы, маркерные белки, моделирование)

SI Рис.

Кривые роста монокультур и SynCom в почвенно-определяемой среде (SDM) в течение 42 часов. Показания оптической плотности снимали на многомодовом считывающем устройстве для микропланшетов на основе монохроматора Biotek Synergy h2m, λ = 600 нм и длине пути 4,2 мм. Относительное стандартное отклонение (RSD; n = 3) для всех штаммов было <5% и представлено заштрихованной областью.

SI Рис. 2.

Истощение экзометаболита монокультурами и SynCom в SDM через 6 часов. Относительное содержание метаболитов измеряли с помощью ЖХ-МС, и максимальную интенсивность каждого метаболита нормализовали относительно контрольной среды.Обозначения штаммов сокращены следующим образом: Mh-M. hominis, Cn-C. necator, Bs-Brevundimonas sp ., Ps-P. soli, Вп-В. paradoxus и Sc- SynCom. Данные представлены как среднее значение повторов (n = 3).

SI Рис. 3.

Проверка рибосомных маркерных белков в пятичленном смешанном сообществе. Изоляты выращивали в течение ночи как монокультуры в SDM. Культуры промывали и нормализовали до 0,1 ОП (600 нм) перед разбавлением и смешиванием до определенных композиций сообщества.Отдельные белки использовали в качестве маркеров для каждого штамма и отслеживали с помощью MALDI-TOF MS для определения относительных соотношений. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего (n = 4).

SI Рис. 4.

Наиболее подходящие модели (красные линии) и экспериментальные данные (черные маркеры) истощения глютамина с течением времени с использованием модели Берендса для каждой из трех повторностей пяти бактериальных монокультуры. BS -Brevundimonas sp ., CN -C. некатор , Mh -M. hominis , Пс -П.soli , Vp -V. Парадокс . Для Brevundimonas sp ., C. necator и P. soli один повтор дал сингулярную ошибку градиента во время подбора кривой, вероятно, из-за недостаточного количества уникальных точек данных, поэтому может быть более одного оптимального решения для значений параметров.

SI Рис. 5.

Наиболее подходящие модели (красные линии) и экспериментальные данные (черные маркеры) истощения фенилаланина с течением времени с использованием модели Берендса для каждой из трех повторностей пяти бактериальных монокультур.BS -Brevundimonas sp ., CN -C. некатор , Mh -M. hominis , Пс -П. soli , Vp -V. Парадокс .

SI Рис. 6.

Расчетные значения ширины для использования субстратов a, ) глутамина и b, ) фенилаланина для каждой монокультуры. Буквы обозначают значительные различия ( p <0,05) между видами для одного и того же субстрата с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с апостериорным тестом Tukey HSD (n = 3, за исключением глутамина n = 2 для Brevundimonas sp ., C. necator и P. soli ; SI Таблица 1).

SI Рис. 7.

¹³ Исследование мечения С-глюкозой для определения максимального фактора маркировки белка-маркера рибосом в монокультурах (т.е. 100% -ное обогащение). Штаммы выращивали в среде, меченной ¹³ С-глюкозой, в течение 18 часов перед MALDI-TOF MS-анализом биологических реплик (n = 4), чтобы гарантировать, что включение субстрата может быть точно отслежено в маркерный белок. Поскольку глюкоза является предпочтительным источником бактериального углерода, ее используют для обеспечения верхнего предела (100% включения) включения ¹³ ° C.Параллельные эксперименты по выращиванию в немеченой среде использовали для определения нижней границы масштабирования (включение 0%) для каждого данного рибосомального маркерного белка. Значение R-квадрата 0,994 подтвердило высокий уровень корреляции между наблюдаемым сдвигом массы, полученным из профилирования белков рибосомных маркеров, и теоретическим общим обогащением углерода, рассчитанным на основе количества атомов углерода в каждом белке и естественного содержания ¹³ C.

Благодарности

Этот материал ENIGMA-Экосистемы и сети, интегрированные с генами и молекулярными сборками (http: // enigma.lbl.gov), программа направления науки в Национальной лаборатории Лоуренса Беркли основана на работе, поддерживаемой U . S. Министерство энергетики, Отдел науки, Отдел биологических и экологических исследований, номер контракта DE-AC02-05Ch21231 .

Ссылки

1. 1.17
2. 2.↵
3. 3.↵
4. 4.↵
5. 5.↵
6. 6.↵
7. 7.↵
8. 8.↵
9. 9.↵
10. 10.↵
11. 11.↵
12. 12.↵
13. 13.↵
14. 14.↵
15. 15.↵
16. 16.↵
17. 17.↵
18. 18.↵
19. 19.↵
20. 20.↵
21. 21.↵
22. 22.
23. 23.↵
24. 24.↵
25. 25.
26. 26.↵
27. 27.↵
28. 28.
29. 29.
30. 30.↵
31. 31.↵
32. 32.↵
33. 33 .↵
34. 34.↵
35. 35.↵
36. 36.↵
37. 37.↵
38. 38.↵
39. 39.↵
40. 40.↵
41. 41.
42. 42.↵
43. 43.↵
44. 44.↵
45. 45.↵
46. 46.↵
47. 47.↵

    Hoopes, JT, Elberson, MA, Preston, RJ, Reddy, PT & Kelman, Z. Мечение белков в Escherichia coli с помощью ¹² H, ¹³ C и ¹⁵ N. в Methods in Enzymology vol. 565 27–44 (Academic Press Inc., 2015).

48. 48.↵
49. 49.↵
50. 50.↵
51. 51.↵
52. 52.↵
53. 53.↵
54. 54.↵
55. 55.↵
56. 56.↵
57. 57.↵
58. 58.↵
59. 59.↵
60. 60.↵

    Тильман Д. Конкурс ресурсов и структура сообщества. (Издательство Принстонского университета, 1982).

61. 61.↵
62. 62.↵
63. 63.↵
64. 64.↵

    Atlas, R.M. & Parks, L.C. Справочник по микробиологическим средам. (CRC Press, 1993).

65. 65.↵
66. 66.↵

    Wilkins, M. R. et al. Инструменты идентификации и анализа белков на сервере ExPASy.В «Методах молекулярной биологии» (Клифтон, Нью-Джерси), т. 112 531–552 (Humana Press, 1999).

67. 67.↵
68. 68.↵
69. 69.↵

новый дыхательный изолят арсената, который может использовать ароматические субстраты | FEMS Microbiology Ecology

Аннотация

Из донных отложений озера Онондага (Сиракузы, штат Нью-Йорк) была выделена новая анаэробная бактерия, которая может использовать арсенат [As (V)] в качестве респираторного акцептора электронов. Изолят, обозначенный штаммом Y5, представляет собой спорообразующий подвижный стержень с боковыми жгутиками.Он грамотрицательный, хотя филогенетически относится к грамположительным организмам с низким G + C. В дополнение к более обычным донорам электронов, таким как лактат и сукцинат, штамм Y5 также может использовать H ₂ + CO ₂ химиоавтотрофно и метаболизировать ароматические соединения, такие как сиринговая кислота, феруловая кислота, фенол, бензоат и толуол, связанные с арсенатом. снижение. Помимо As (V), нитрат, сульфат, тиосульфат и Fe (III) также могут служить акцепторами электронов. На основе филогении 16S рДНК и ее физиологических характеристик штамм Y5 был идентифицирован как наиболее близкий к роду Desulfosporosinus .Способность микроорганизмов восстанавливать арсенат для дыхания, по-видимому, широко распространена и может иметь значение для биогеохимического цикла мышьяка в средах, содержащих смешанные загрязнители.

1 Введение

Мышьяк, 20-й элемент земной коры по распространенности, широко распространен в природе в результате выветривания, растворения, пожара и вулканической активности. Антропогенные поступления включают использование мышьяка в пестицидах, гербицидах, консервантах для древесины и красителях, а также в мышьякосодержащих отходах, образующихся при плавке и добыче полезных ископаемых.В окружающей среде As (V) и As (III) составляют основную часть неорганических форм, обнаруживаемых в природных водах и отложениях [1]. As (III) более подвижен и токсичен для человека и экосистемы, в то время как As (V) более поглощает матрицу окружающей среды. В окружающей среде, богатой мышьяком, серьезную озабоченность вызывает возможность мобилизации и переноса этого токсичного элемента в грунтовые воды и источники питьевой воды. В природной воде зарегистрированные диапазоны концентраций мышьяка составляют от 0,5 мкг / л ^-1 до более 5000 мкг / л ^-1 [2].Недавно максимальный уровень загрязнения мышьяком в системе водоснабжения был снижен с 50 до 10 мкг / л [3].

Микроорганизмы являются посредниками в геохимическом круговороте мышьяка. Было показано, что бактерии и фитопланктон способны окислять [4,5], метилировать [6,7] и восстанавливать мышьяк [7]. Восстановление As (V) до As (III) микроорганизмами может служить механизмом детоксикации или диссимиляционным восстановлением арсената (дыханием) [8]. Процесс детоксикации мышьяка хорошо изучен у ряда организмов и, как сообщается, контролируется генами ars , которые кодируют белки, ответственные за восстановление As (V) с последующим удалением As (III) из клетки посредством оттока. насос [9,10].

Диссимиляционное восстановление, при котором As (V) используется в качестве акцептора электронов для дыхания и роста, было описано с новым изолятом Sulfurospirillum arsenophilum в 1994 году [11], и с тех пор были идентифицированы другие прокариоты, которые могут достигать роста посредством диссимиляционное восстановление арсената до арсенита [12–21]. Даже с ограниченным числом видов ясно, что это явление полифилетическое. То есть эти организмы филогенетически разнообразны [22]. Кроме того, различные штаммы были изолированы из окружающей среды, такой как отложения, горячие источники и шахтные отходы.Совсем недавно диссимиляционная активность арсенатредуктазы и бактерии, дышащие арсенатом, были выделены из рубцовой жидкости крупного рогатого скота, фекалий хомяков и задней кишки термитов [23].

На сегодняшний день субстратами, на которых были выделены эти штаммы, были простые углеродные соединения, такие как лактат или ацетат. В данной работе рассматривается вопрос о том, могут ли дышащие арсенатом микроорганизмы использовать более сложные субстраты, такие как природные лигноароматические соединения или органические вещества, связанные с опасными отходами.Мы сообщаем о выделении и идентификации новой анаэробной диссимиляционной бактерии, восстанавливающей арсенат, которая может использовать ряд ароматических соединений. Этот изолят физиологически и филогенетически отличается от других сообщенных восстановителей арсената.

2 Материалы и методы

2.1 Рост и состояние среды

Для начального обогащения и роста арсенатредуцирующих бактерий использовали среду с минеральными солями в анаэробных условиях, как описано Evans et al.[24], за исключением того, что нитрат натрия не был включен. Первоначальное обогащение содержало 10 мМ As (V) в качестве концевого акцептора электронов и 10 мМ лактат в качестве донора электронов / источника углерода. PH среды доводили до 7,2.

2,2 Источник посевного материала

Инокулят для обогащающих культур был собран с верхних 20 см отложений озера Онондага, которое представляет собой димиктическую систему, расположенную в столичном Сиракузах, штат Нью-Йорк. Это озеро загрязнено бытовыми и промышленными отходами, включая ртуть, нефть, ПХБ и другие хлорированные соединения, которые сбрасывались с конца 1800-х годов [25–27], и обозначено как объект Суперфонда [28].

2.3 Процедуры обогащения и выделения

Определенная среда была приготовлена ​​в строгих анаэробных условиях [29]. Добавляли посевной материал осадка (10% масс. / Об.) И аликвоты по 100 мл анаэробно распределяли во флаконы для сыворотки объемом 160 мл с аргоном в свободном пространстве. Начальные концентрации лактата и As (V) составляли 10 и 10 мМ соответственно. На основании стехиометрических расчетов количество лактата более чем в 5 раз превышало количество, необходимое для полного восстановления доступного арсената.Бутылки закрывали резиновыми пробками и алюминиевыми обжимными колпачками и статически инкубировали при 30 ° C в темноте. Для обеспечения анаэробных условий все отборы проб и поправки проводились с использованием стерильных пластиковых шприцев, промытых аргоном. Обогащение проводили в трех повторностях с дублированными стерильными (автоклавировали три раза в последовательные дни) и фоновым (без добавления источника углерода) контролями.

Уменьшение 10 мМ As (V) произошло во всех активных флаконах в течение двух недель инкубации.10% -ное разведение активных культур вносили в новую среду и инкубировали, как описано ранее. Разведение обогащения проводили таким образом 10 раз в течение 6 месяцев. После того, как культуры были разбавлены до точки, в которой больше не было осадка, аликвоту культуры разливали в анаэробные встряхиваемые пробирки, приготовленные с определенной средой и содержащие 0,8–1% (вес / объем) стерильного агара (Difco, Детройт, Мичиган). ). После 4 недель инкубации при 30 ° C отдельные колонии собирали и наносили штрихами на новые встряхиваемые пробирки, содержащие 2% (вес / объем) агар, дважды подряд и инкубировали в анаэробных условиях при 30 ° C для обеспечения чистоты.Культуру также наносили штрихами на твердую среду, содержащую только лактат и не содержащую As (V), чтобы гарантировать, что случайные загрязнители не уносятся с собой. Затем чистую культуру выращивали на лактате и As (V) в жидкой анаэробной среде в 100 мл, затем концентрировали центрифугированием и хранили при -80 ° C в 5 мл 50% (об. / Об.) Раствора глицериновой среды, распределяемого в несколько раз. аликвоты и сохранены для дальнейшей характеристики и экспериментов.

2,4 Доноры электронов, используемые для роста

Доноры электронов / источники углерода, протестированные на их способность поддерживать рост штамма Y5, когда As (V) присутствовал в качестве акцептора электронов, включали: H ₂ + CO ₂ (10 мл при 1 атм), формиат (10 мМ), ацетат (10 мМ), H ₂ (10 мл при 1 атм) + ацетат (10 мМ), пропионат (10 мМ), сукцинат (10 мМ), лактат (10 мМ), глюкоза (10 мМ) , дрожжевой экстракт (1 г / л), сиринговая кислота (1 мМ), феруловая кислота (1 мМ), фенол (1 мМ), бензоат (1 мМ) и толуол (0.1 мМ). Пробирки Бальча, содержащие 15 мл жидкой среды без донора электронов и 10 мМ As (V), инокулировали 1,5 мл штамма Y5, который ранее был выращен на 10 мМ лактате и 10 мМ As (V). Эти пробирки инкубировали при 30 ° C в течение трех дней, чтобы обеспечить истощение лактата, который мог быть перенесен с посевным материалом. Через три дня доноры электронов / источники углерода добавляли шприцем из стерильных анаэробных исходных растворов для получения желаемых концентраций. Водород добавляли путем инъекции 10 мл H ₂ в свободное пространство культуральных пробирок с использованием стерильного шприца.Контроли включали отсутствие донора электронов плюс As (V), а также донора электронов плюс отсутствие As (V). Изменения концентрации As (V) и As (III) в культурах отслеживали во время инкубации. Рост как мутность измеряли спектрофотометрически при 580 нм. Результаты считались положительными, если As (V) снижался до As (III) и происходил рост по сравнению со стерильными контролями. Все эксперименты проводились в двух или трех экземплярах.

2,5 Другие акцепторы электронов, используемые для роста

Дополнительные акцепторы электронов, протестированные на их способность поддерживать рост штамма Y5, включали нитрат (5 мМ), нитрит (5 мМ), сульфат (5 мМ), тиосульфат (5 мМ), сульфит (5 мМ), Fe (III) ( 5 мМ) и Cr (VI) (0.15 мМ). Пробирки Балча, содержащие 15 мл жидкой среды и 10 мМ лактата, инокулировали 1,5 мл штамма Y5, который ранее выращивали на 10 мМ лактате и 10 мМ As (V). Каждый акцептор электронов добавляли из стерильного анаэробного исходного раствора, и все культуры инкубировали при 30 ° C. Через три недели отбирали образцы культур для обнаружения изменений концентрации каждого акцептора электронов. Рост как мутность измеряли спектрофотометрически при 580 нм. Результаты считались положительными, если количество подаваемых акцепторов уменьшалось и происходил рост клеток.Все эксперименты проводили в трех повторностях.

2,6 Химические вещества

Все химические вещества были реактивными и использовались без дополнительной очистки. Все растворы готовили на стерильной дистиллированной деионизированной воде. Исходный раствор As (III) готовили из твердого триоксида мышьяка, As ₂ O ₃ (Aldrich, A.C.S. первичный стандарт). Исходный раствор As (V) готовили из Na ₂ HAsO ₄ · 7H ₂ O (Sigma), растворенного в стерильной дистиллированной деионизированной воде.

2,7 Анализы

Жидкие пробы отбирались периодически для анализа. Образцы суспензии осадка (от обогащения) или только жидкости (во всех других экспериментах) (0,5–1,0 мл) пропускали через пробки с помощью стерильных шприцев объемом 1,0 мл с иглами калибра 16, предварительно промытых аргоном. Образцы переносили во флаконы для центрифугирования с нейлоновыми фильтрами с размером пор 0,2 мкм (VWR Scientific, West Chester, PA) и центрифугировали в течение 2 мин в настольной микроцентрифуге для удаления всех взвешенных материалов.

Концентрацию As (III) и As (V) в отфильтрованных образцах измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Шимадзу, Колумбия, Мэриленд) с анионообменной колонкой Hamilton PRP-X100 и определяли по УФ-поглощению при 195 нм. Используемая подвижная фаза представляла собой 30 мМ натрий-фосфатный буфер с pH 6,0. Скорость потока составляла 1,0 мл / мин, а объем инъекции составлял 10 мкл.

Концентрации лактата, сукцината и ацетата определяли с помощью ВЭЖХ (Beckman, Fullerton, CA), снабженной 7.Колонка Rezex ROA с органической кислотой 8 мм × 50 см (Phenomenex, Торранс, Калифорния) с УФ-детектированием при 210 нм. Подвижная фаза состояла из 0,005 N H ₂ SO ₄ при скорости потока 0,5 мл / мин. Колонку поддерживали при комнатной температуре, а объем ввода составлял 20 мкл.

Концентрацию фенола, бензоата, сиреневой кислоты и феруловой кислоты измеряли с помощью ВЭЖХ (Beckman, Fullerton, CA), снабженной колонкой Ultrasphere C18 4,6 мм × 25 см (Beckman) с УФ-детектированием при 280 нм. Подвижная фаза состояла из 60% метанола, 38% воды и 2% уксусной кислоты.Скорость потока составляла 1 мл / мин, а объем инъекции составлял 20 мкл.

Сульфатные, сульфитные, нитратные и нитритные анализы были выполнены на ионном хроматографе Dionex (Саннивейл, Калифорния) модель 100 с колонкой IonPac AS9 с использованием определения проводимости. Элюант содержал 2 мМ Na ₂ CO ₃ и 0,75 мМ NaHCO ₃ со скоростью потока 2,0 мл / мин. Регенерирующий агент состоял из 25 мМ H ₂ SO ₄ под He при 8 фунтах / дюйм ² .

Fe (II) и Fe (III) были измерены с использованием колориметрической методики, описанной Hacherl [30].Восстановление Cr (VI) определяли по стандартной колориметрической методике [31].

Концентрации белка в образцах культур определяли методом Брэдфорда [32] с использованием модифицированной версии анализа белка Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Поглощение считывали при 595 нм. Аликвоту 5 мл каждого образца центрифугировали при 3000 об / мин в течение 15 мин и супернатант отбрасывали. Клетки промывали 5 мл фосфатного буфера (50 мМ, pH 7,2), снова центрифугировали еще 15 мин и супернатант отбрасывали.Промытые клетки ресуспендировали в 900 мкл свежего фосфатного буфера и добавляли 100 мкл 10 н. NaOH. Образцы кипятили в течение 15 минут и после охлаждения доводили pH до 7 с помощью 5 н. HCl, после чего определяли концентрацию белка в соответствии с протоколом Bio-Rad.

2,8 Просвечивающая электронная микрофотография

Клетки штамма Y5 подвергали отрицательной нагрузке 2% фосфорновольфрамовой кислотой и просматривали и фотографировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Hitachi H-7000.

2,9 Спорообразование

Чтобы проверить, может ли штамм Y5 образовывать термостойкие споры, трижды культуры Y5 выращивали до стационарной фазы на 10 мМ лактате и 10 мМ As (V). Культуру инкубировали при 85 ° C в течение 30 мин, затем переносили в свежую среду и инкубировали при 30 ° C. Образцы культуры отбирали ежедневно для анализа изменения концентрации As (V), As (III) и белка.

2.1 Выделение гена рРНК 016S, секвенирование и филогенетический анализ

Геномную ДНК выделяли из штамма Y5, как описано ранее Rainey et al.[33]. Ген 16S рРНК был амплифицирован из геномной ДНК с использованием эубактериальных праймеров 27F и 1525R [34]. Каждая 50-мкл смесь для ПЦР содержала следующее: 5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 мкл дезоксинуклеозидтрифосфатов (10 мМ каждого, Invitrogen), 1,5 мкл MgCl ₂ (50 мМ, Invitrogen ), 2 мкл каждого праймера (10 пМ, Invitrogen), 0,4 мкл ДНК-полимеразы Taq (5 U мкл ^-1 , Invitrogen), 2 мкл матрицы ДНК (50 нг) и стерильная деионизированная вода для доведения конечный объем 50 мкл.ДНК амплифицировали в системе Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400 с начальной стадией денатурации 95 ° C в течение 5 минут с последующими 30 циклами: 94 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 1 часа. мин, с последним продлением на 10 мин при 72 ° C. После проверки продукта ПЦР на 1% агарозном геле продукт ПЦР очищали с использованием QIAquick Spin Cleanup для очистки ПЦР (Qiagen, Chatsworth, CA). Для прямого секвенирования ампликона использовали ABI Prism ^® BigDye ^TM Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).Каждая реакция секвенирования содержала: 4 мкл готовой реакционной смеси BigDye ^TM Terminator v3.0, 100 нг очищенного продукта ПЦР, 25 нг праймера для секвенирования и стерильную деионизированную воду до конечного объема 10 мкл. Реакции секвенирования амплифицировали, как описано производителем, с использованием эубактериальных праймеров 27F, 530F, 926F, 519R, 1100R и 1525R [34] для секвенирования обеих цепей ДНК. После секвенирования амплификации реакции очищали, ресуспендировали в 15 мкл формамида и секвенировали с использованием генетического анализатора ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).

Родственные последовательности 16S рРНК были идентифицированы с использованием BLAST с сегментом 1500 оснований гена Y5. Выравнивание последовательностей проводили с использованием ClustalX [36], а сходство последовательностей определяли с помощью PHYLIP [37]. Деревья соединения соседей и значения начальной загрузки, выраженные в процентах от 1000 повторов, были построены с использованием ClustalX [36]. Следующие последовательности были получены из GenBank и RDP [35], номера доступа в GenBank указаны в скобках: Desulfomicrobium sp. ‘Bendigo B’ (AF131233), Desulfonispora thiosulfatigenes (генбанк: Y18214), Dehalobacter restrictus (генбанк: Y10164), Desulfitobacterium Metallireducens (генбанк: AF297871), Desulfitobacterium: X38397871), Desulfitobacterium frappieri (генбанк: U40078), Desulfosporosinus orientis (генбанк: Y11571), Desulfosporosinus meridiei (генбанк: AF076247), Desulfotomaculum ( Desulfosporosinus ) ( Desulfosporosinus ) (генобанк: генбанк: Y11567), Desulfotomaculum thermocistern (генбанк: AF295662), Thermoterrabacterium ferrireducens (генбанк: U76364), Desulfotomaculum acetoxidans (генбанк: Y11566), Desulfotomaculum ( ^{Desulfonautomaculum), генбанк: U95951), Succinispira mobilis (генбанк: AJ006980), 900 38 Anaerosinus glycerini (генбанк: AJ010960), Propionispira arboris (генбанк: Y18190), Centipeda periodontii (генбанк: AJ010963), Anaerovibrio lipolytica (генбанк: AB01034191) и .Последовательность 16S рРНК для изолята Y5 депонирована под номером доступа GenBank: AY233860.}

2.11 Анализ генов RuBisCO

Для дальнейшей оценки способности штамма Y5 к автотрофному росту, гены типа I ( cbbL ) и типа II ( cbbM ) искали с помощью ПЦР-амплификации рибулозо-1,5′-бифсофаткарбоксилазы / оксигеназы ( RuBisCO), как описано Эльсайедом и Наганумой [38]. Сегмент из 800 пар оснований гена cbbL амплифицировали с использованием прямого (5′-GACTTCACCAAAGACGACGA-3 ‘) и обратного праймеров (5′-TCGAACTTGATTTCTTTCCA-3’).Для гена cbbL типа I начальная стадия денатурации проводилась при 94 ° C в течение 2 минут, затем следовала денатурация при 94 ° C в течение 1 минуты, отжиг при 62 ° C в течение 1 минуты и удлинение при 72 ° C в течение 3 минут. мин на 30 циклов, с последним продлением на 15 мин при 72 ° C. Результаты были отрицательными для гена cbbL .

Набор праймеров, используемый для амплификации гена типа II, включал прямой праймер (5′-ATCATCAARCCSAARCTSGGCCTGCGTCCC-3 ‘) и обратный праймер (5′-MGAGGTGACSGCRCCGTGRCCRGCMCGRTG-3’), в результате чего получился фрагмент cbbM из 40038 пар оснований Ген [38].Ген cbbM амплифицировали путем начальной денатурации при 94 ° C в течение 2 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 94 ° C в течение 1 минуты, отжигом при 62 ° C в течение 1 минуты и удлинением при 72 ° C в течение 3 минут. , с окончательной выдержкой в ​​течение 15 мин при 72 ° C. Затем амплифицированный ген cbbM секвенировали, и последовательность подтверждали известными последовательностями гена RuBisCO Type II cbbM , найденными в GenBank.

3 Результаты

3.1 Изоляция и морфологические характеристики изолята

Изолят, обозначенный штаммом Y5, представляет собой подвижную палочковидную бактерию, имеющую от одного до двух прикрепленных сбоку жгутиков и продуцирующих эндоспоры (рис.1 (а)). Клетки штамма Y5 были грамотрицательными с некоторой вариабельностью. Электронные микрофотографии отрицательно окрашенных клеток также показали инвагинированные клеточные стенки, типичные для грамотрицательных организмов. Средний размер клеток штамма Y5 составлял около 2 мкм в длину и 0,5 мкм в ширину. На твердой среде колонии штамма Y5 изначально казались белыми с желтым пигментом, образовавшимся примерно через три недели инкубации. Колонии примерно 0,5–1,5 мм в диаметре с закругленными краями (рис. 1 (б)).

1

Колонии и электронная микрофотография штамма Y5.(а) Электронная микрофотография штамма Y5. (б) Колонии штамма Y5, выросшие в анаэробных условиях на твердой среде, содержащей 10 мМ лактата и 10 мМ арсената.

1

Колонии и электронная микрофотография штамма Y5. (а) Электронная микрофотография штамма Y5. (б) Колонии штамма Y5, выросшие в анаэробных условиях на твердой среде, содержащей 10 мМ лактата и 10 мМ арсената.

Культуры, подвергнутые термообработке для уничтожения жизнеспособных клеток, инкубировали в среде с 10 мМ лактатом и 10 мМ As (V). После 7 дней инкубации при 30 ° C было достигнуто полное восстановление As (V) до As (III).Споры наблюдались также при воздействии кислорода на культуры.

3.2 Биологическое восстановление As (V) до As (III)

На фиг. 2 показана концентрация клеточного белка штамма Y5 после инкубации в течение 14 дней в определенной среде с приблизительно 0,5 мМ сиреневой кислоты в отсутствие и в присутствии 6 мМ As (V). После 14-дневного периода инкубации концентрация белка для штамма Y5 при добавлении к среде 6 мМ As (V) составляла 290,00 мкг / мл. Конечная концентрация белка без добавления As (V) составляла 27.70 мкг / мл и 24,59 мкг / мл белка рассчитывали для автоклавированных стерильных контролей, которые получали 6 мМ As (V) перед инкубацией. Следовательно, рост штамма Y5 зависел от мышьяка.

2

Концентрация белка штамма Y5 после выращивания в течение 14 дней в отсутствие и в присутствии As (V). Начальная концентрация As (V) и сиреневой кислоты составляла 6 и 0,5 мМ соответственно. As (V) полностью восстановился до As (III) за 14 дней. Представленные данные представляют собой средние значения трех повторов, а планки ошибок представляют стандартные отклонения.Стерильные контроли инокулировали и автоклавировали.

2

Концентрация белка штамма Y5 после выращивания в течение 14 дней в отсутствие и в присутствии As (V). Начальная концентрация As (V) и сиреневой кислоты составляла 6 и 0,5 мМ соответственно. As (V) полностью восстановился до As (III) за 14 дней. Представленные данные представляют собой средние значения трех повторов, а планки ошибок представляют стандартные отклонения. Стерильные контроли инокулировали и автоклавировали.

3.3 Восстановление As (V) в сочетании с разложением ароматических соединений

Было обнаружено, что штамм Y5 способен разлагать ряд ароматических соединений, связанных с восстановлением As (V). Испытанные соединения включали сиринговую и феруловую кислоты, фенол, бензоат и толуол. На рис. 3 (а) показано, что после задержки происходит полное восстановление 6 мМ As (V) до As (III), в то время как 0,5 мМ сиринговая кислота расходуется в качестве донора электронов / источника углерода в течение 14 дней. . В стерильных контролях, в которых инокулированные бактерии были автоклавированы, снижение As (V) не обнаружено.При восстановлении As (V) образуются стехиометрические количества As (III), и никаких элементарных As или AsH ₃ обнаружено не было, следовательно, As (V) был полностью восстановлен до As (III) изолятом Y5. Когда 1,5 мМ феруловой кислоты подавали в качестве единственного донора электронов / источника углерода, 7,5 мМ As (V) стехиометрически восстанавливались до As (III) в течение 21 дня (рис. 3 (b)), и восстановление As (V) одновременно с потерей феруловой кислоты. Относительные скорости восстановления арсената для различных испытанных ароматических соединений находятся в следующем порядке: сиринговая кислота> феруловая кислота> фенол / бензоат (данные не показаны).

3

Восстановление арсената в сочетании с разложением лигноароматических соединений. (а) сиринговая кислота, (б) феруловая кислота. Представленные данные представляют собой средние значения трех повторов, а планки ошибок представляют стандартные отклонения.

3

Восстановление арсената в сочетании с разложением лигноароматических соединений. (а) сиринговая кислота, (б) феруловая кислота. Представленные данные представляют собой средние значения трех повторов, а планки ошибок представляют стандартные отклонения.

Толуол также был протестирован как возможный источник углерода для роста изолятом Y5, связанным с респираторным восстановлением As (V). Фиг.4 иллюстрирует восстановление As (V) и разложение толуола штаммом Y5 в течение 17-дневного периода инкубации, где 2,68 мМ As (V) полностью восстанавливались до As (III), а 0,237 мМ толуола использовали в качестве единственного C -источник. Других видов мышьяка не обнаружено. Когда толуол присутствовал, но не добавлялся As (V), не было очевидной потери толуола, что указывает на то, что метаболизм толуола зависит от восстановления As (V).Дальнейшее подтверждение потери толуола, связанного с восстановлением As (V), было выведено из стехиометрии реакции с использованием следующего уравнения: 1 Если предположить, что потерянный толуол (0,237 мМ) полностью метаболизировался до CO ₂ , тогда прогнозируемое количество образующегося As (III) должно составлять 3,32 мМ. Это близко к фактически измеренной концентрации (2,68 мМ).

4

Восстановление арсената в сочетании с разложением толуола. Данные представляют собой средние значения трех повторов, а полосы ошибок представляют стандартные отклонения.

4

Восстановление арсената в сочетании с разложением толуола. Данные представляют собой средние значения трех повторов, а полосы ошибок представляют стандартные отклонения.

3.4 Рост с другими донорами и акцепторами электронов

Профили использования источников углерода и доноров электронов для Y5 приведены в таблице 1. Следующие доноры электронов и источники углерода поддерживали рост: лактат, H ₂ , H ₂ + ацетат, сукцинат, дрожжевой экстракт, сиринговая кислота, феруловая кислота. , фенол, бензоат и толуол.Формиат, ацетат, пропионат и глюкоза не поддерживали рост. Когда неорганический CO ₂ поставлялся в качестве единственного источника углерода, штамм Y5 был способен расти автотрофно и использовать H ₂ для восстановления As (V). Положительная ПЦР-амплификация показала, что штамм Y5 содержал ген RuBisCO типа II, cbbM , но не ген типа I cbbL (данные не показаны). Последовательность cbbM на 91% (совпадение 618/674 оснований) была аналогична последовательности Thiobacillus denitrificans (номер доступа genbank: L37437) (данные не показаны).

1

Соединения, испытанные в качестве доноров электронов для штамма Y5, по сравнению с Desulfosporosinus auripigmentum [18] и Desulfosporosinus meridiei [41]

ND 9 1061 D62 Propionate — 910 Проверенные соединения 910 в качестве доноров электронов для штамма Y5 по сравнению с Desulfosporosinus auripigmentum [18] и Desulfosporosinus meridiei [41]

Доноры электронов (мМ)	Y5	900	D. meridiei
Сиринговая кислота (1 мМ)	+	ND	+
Феруловая кислота (1 мМ)	+								ND Фенол (1 мМ)	+	—	ND
Бензоат (1 мМ)	+	—	—
Толуол (0.1 мМ)	+	—	ND
Формиат (10 мМ)	—	ND	ND
Ацетат (10 мМ)63
Пропионат (10 мМ)	—	ND	ND
Сукцинат (10 мМ)	+	—	ND
H (1 ат. мМ)	+	+	+
Глюкоза (10 мМ)	—	—	ND
Дрожжевой экстракт (1 г / л)	—	— 910D
Лактат (10 мМ)	+	+	+
H 2 (1 атм) + CO 2	+	+	Доноры электронов (мМ)	Y5	D.auripigmentum	D. meridiei
Шприцевая кислота (1 мМ)	+	ND	+
Феруловая кислота (1 мМ 1062
Фенол (1 мМ)	+	—	ND
Бензоат (1 мМ)	+	—	—
							—	ND
Формиат (10 мМ)	—	ND	ND
Ацетат (10 мМ)	—	—	ND	ND
Сукцинат (10 мМ)	+	—	ND
H 2 (1 атм) + Ацетат (10 мМ) 9106 3	+	+	+
Глюкоза (10 мМ)	—	—	ND
Дрожжевой экстракт (1 г / л)	+	—	—	—
Лактат (10 мМ)	+	+	+
H 2 (1 атм) + CO 2	+	+	ND

D62 Propionate — Доноры электронов (мМ) D62 Propionate —3 результаты из 910 Экранирование терминальных акцепторов электронов сведено в Таблицу 2.Когда штамм Y5 выращивали в минимальной среде с лактатом в качестве донора электронов и источника углерода, нитрат, сульфат, тиосульфат и Fe (III) могли использоваться в качестве акцепторов электронов. Нитрит, сульфит и Cr (VI) не способствовали росту.

2

Соединения, испытанные в качестве акцепторов электронов для штамма Y5, по сравнению с Desulfosporosinus auripigmentum [18] и Desulfosporosinus meridiei [41]

Доноры электронов (мМ)	Y5	D.auripigmentum	D. meridiei
Шприцевая кислота (1 мМ)	+	ND	+
Феруловая кислота (1 мМ 1062
Фенол (1 мМ)	+	—	ND
Бензоат (1 мМ)	+	—	—
							—	ND
Формиат (10 мМ)	—	ND	ND
Ацетат (10 мМ)	—	—	ND	ND
Сукцинат (10 мМ)	+	—	ND
H 2 (1 атм) + Ацетат (10 мМ) 9106 3	+	+	+
Глюкоза (10 мМ)	—	—	ND
Дрожжевой экстракт (1 г / л)	+	—	—	—
Лактат (10 мМ)	+	+	+
H 2 (1 атм) + CO 2	+	+	ND
Y5	D.auripigmentum	D. meridiei
Шприцевая кислота (1 мМ)	+	ND	+
Феруловая кислота (1 мМ 1062
Фенол (1 мМ)	+	—	ND
Бензоат (1 мМ)	+	—	—
							—	ND
Формиат (10 мМ)	—	ND	ND
Ацетат (10 мМ)	—	—	ND	ND
Сукцинат (10 мМ)	+	—	ND
H 2 (1 атм) + Ацетат (10 мМ) 9106 3	+	+	+
Глюкоза (10 мМ)	—	—	ND
Дрожжевой экстракт (1 г / л)	+	—	—	—
Лактат (10 мМ)	+	+	+
H 2 (1 атм) + CO 2	+	+ 063	ND

) (0.15 мМ)

Акцепторы электронов	Y5	D.auripigmentum	D. meridiei
As (V) (10 мМ)	+	+	—
Нитрат (5 мМ1062 —	)
Нитрит (5 мМ)	—	ND	ND
Сульфат (5 мМ)	+	+	+
								+	+
Тиосульфат (5 мМ)	+	+	+
Fe (III) (5 мМ)	+	—
—	ND	ND

N1063

Акцепторы электронов	Y5	D. auripigmentum	D. 10 мМ)	+	+	—
Нитрат (5 мМ)	+	—	—
Нитрит (5 мМ)
Сульфат (5 мМ)	+	+	+
Сульфит (5 мМ)	—	+	+
+		Тиосульфат (5 мМ)	+
Fe (III) (5 мМ)	+	—	+
Cr (VI) (0.15 мМ)	—	ND	ND

2

Соединения, испытанные в качестве акцепторов электронов для штамма Y5, по сравнению с Desulfosporosinus auripigmentum [18] и Desulfosporosinus meridiei [4110] Акцепторы электронов Y5 D. auripigmentum D. meridiei As (V) (10 мМ) + + 910rate ) + — — Нитрит (5 мМ) — ND ND Сульфат (5 мМ) Сульфит (5 мМ) — + + Тиосульфат (5 мМ) + + + 910 61 Fe (III) (5 мМ) + — + Cr (VI) (0.15 мМ) — ND ND

N1063

Акцепторы электронов	Y5	D. auripigmentum	D. 10 мМ)	+	+	—
Нитрат (5 мМ)	+	—	—
Нитрит (5 мМ)
Сульфат (5 мМ)	+	+	+
Сульфит (5 мМ)	—	+	+
+		Тиосульфат (5 мМ)	+
Fe (III) (5 мМ)	+	—	+
Cr (VI) (0.15 мМ)	—	ND	ND

В таблицах 1 и 2 также перечислены профиль донора электронов и профиль акцептора электронов бактериальных штаммов, с которыми штамм Y5 наиболее близок, и это будет обсуждаться далее. .

3.5 Филогенетическая характеристика

Результат поиска BlastN гена 16S рРНК для изолята Y5, основанный на сегменте из 1500 нуклеотидов, показал тесную связь с Desulfosporosinus meridiei (сходство последовательностей 97%, совпадение оснований 1407/1447) и Desulfotomaculum auripigmentum (96% сходство последовательностей, совпадение 1223/1269 оснований), известной дышащей арсенатом бактерии [18], которая недавно была реклассифицирована как Desulfosporosinus auripigmentum [39].Филогенетическая дендрограмма на основе 1300 нуклеотидного сегмента гена 16S рРНК была построена для сравнения последовательности изолята Y5 с другими членами класса δ-Proteobacteria (рис. 5). На основании филогенетической дендрограммы изолят Y5 принадлежал к группе Peptococcaceae и разветвился между видами Desulfosporosinus meridiei и Desulfosporosinus auripigmentum (значения бутстрапа 68% и 70% соответственно).

5

Филогенетическая дендрограмма на основе сравнения последовательностей 16S рДНК 1300 оснований.Дерево объединения соседей было получено с помощью ClustalX, значения начальной загрузки (выраженные в процентах от 1000 повторов) показаны в точках ветвления, а полоса соответствует 2% разнице. На основании сравнения последовательностей 16S рДНК изолят Y5 принадлежит к группе Peptococcaceae и близок к Desulfosporosinus meridiei и Desulfosporosinus auripigmentum .

5

Филогенетическая дендрограмма на основе сравнения последовательностей 16S рДНК 1300 оснований. Дерево объединения соседей было получено с помощью ClustalX, значения начальной загрузки (выраженные в процентах от 1000 повторов) показаны в точках ветвления, а полоса соответствует 2% разнице.На основании сравнения последовательностей 16S рДНК изолят Y5 принадлежит к группе Peptococcaceae и близок к Desulfosporosinus meridiei и Desulfosporosinus auripigmentum .

4 Обсуждение

Выделенный из озера Онондага, указанного в Суперфонде, штамм Y5, строго анаэробная респираторная бактерия, восстанавливающая As (V), подвижна с 1 или несколькими перитрихиальными боковыми жгутиками и продуцирует споры. Интересно, что он окрашивает грамотрицательные клетки и, по-видимому, имеет инвагинированную внешнюю клеточную стенку, типичную для грамотрицательных организмов, хотя филогенетически помещается в споры, образующие подтип Clostridium / Bacillus грамположительных бактерий.Недавно Desulfotomaculum auripigmentum, другой известный изолят, дышащий арсенатом, который окрашивает грамотрицательные, но филогенетически кластеры в группе грамположительных Peptococcaceae с низким G + C, был реклассифицирован как Desulfosporosinus auripigmentum [39]. Хотя это может показаться парадоксальным, в литературе можно найти другие примеры анаэробных микроорганизмов, которые являются грамотрицательными спорообразующими, и включают Pelospora glutarica [40], Cetobacterium ceti [41] и Propionispora vibroides [42]. ].По филогенетическим и физиологическим характеристикам штамм Y5 наиболее близок к роду Desulfosporosinus [43]. Это согласуется с его способностью восстанавливать сульфат и тиосульфат до сульфида, а также с наблюдением, что он легко образует споры при воздействии кислорода.

As (V) используется в качестве респираторного акцептора электронов для роста штаммом Y5. Рост зависит от уменьшения As (V), и рост не происходит, когда As (V) не предоставляется (рис. 2). Кроме того, имеет место стехиометрическое превращение As (V) в As (III) (рис.3).

По сравнению с ранее описанными диссимиляционными восстановителями As (V), которые все были проверены на лактат или ацетат, особенно интересно отметить, что штамм Y5 имеет широкий диапазон субстратов, который включает лигноароматические соединения, сиринговую и феруловую кислоты, а также ароматические такие соединения, как фенол, бензоат и компонент бензина толуол (Таблица 1). Насколько нам известно, об использовании источников ароматического углерода в сочетании с восстановлением As (V) ранее не сообщалось. Кроме того, штамм Y5 способен к автотрофному росту на H ₂ / CO ₂ и имеет ген RuBisCO типа II, cbbM .Сообщалось, что анаэробные фиксирующие CO ₂ микроорганизмы обычно имеют форму RuBisCO типа II, но не тип I [38].

Кроме того, штамм Y5 отличается от других диссимиляционных восстановителей As (V) в диапазоне других акцепторов электронов, которые он может использовать. Восстановители арсената, описанные в литературе, по-видимому, также восстанавливают либо нитрат [10,13,14,41], либо сульфат [15,17], в то время как штамм Y5 может восстанавливать оба, в дополнение к ряду других акцепторов электронов (Таблица 2).Кроме того, поскольку как As (V), так и Fe (III) могут быть восстановлены штаммом Y5, это может повлиять на распределение и транспорт мышьяка в бескислородной среде. Известно, что сорбция As (V) водным марганцем, алюминием и Fe (III) происходит в отложениях [44,45]. Организм, такой как штамм Y5, восстанавливая Fe (III) до Fe (II), потенциально может высвобождать связанный Fe (III) As (V), делая его доступным для дальнейшей химической или биологической атаки. Фактически, мобилизация As (V) в отложениях Fe (III) -редуцирующими бактериями была описана [46] и предложена в качестве источника мышьяка в скважинах Бангладеш [47].Штамм Y5 может влиять на транспорт мышьяка, во-первых, высвобождая связанный As (V) из оксигидроксидов Fe (III) посредством восстановления Fe (III), а во-вторых, мобилизуя мышьяк путем восстановления As (V) до более растворимого и подвижного As (III).

Филогенетически штамм Y5 наиболее близок к Desulfosporosinus meridiei и недавно реклассифицированному Desulfosporosinus auripigmentum (ранее Desulfotomaculum auripigmentum ) [39]. Штамм Y5 имеет некоторые общие физиологические характеристики с каждым, однако различия также заметны.Во-первых, D. meridiei не может восстанавливать As (V), в то время как штаммы Y5 и D. auripigmentum могут. Штамм Y5 может использовать нитрат и Fe (III) в качестве акцепторов электронов, а штамм D. auripigmentum — нет. Все 3 штамма могут использовать сульфат и тиосульфат. С другой стороны, штамм Y5 не может использовать сульфит, в то время как D. auripigmentum и D. meridiei могут. Что касается органических субстратов, фенол, бензоат и толуол могут использоваться в качестве доноров электронов и субстратов для роста штаммом Y5 и не могут использоваться в D.Аурипигмент . В отличие от D. auripigmentum , штамм Y5 сходен с D. meridiei по способности продуцировать споры.

Способность штамма Y5 связывать восстановление As (V) с деградацией ароматических соединений особенно интересна в свете того факта, что многие сайты Superfund (на основе запроса базы данных EPA Superfund, http: //www.epa .gov / superfund) содержат как мышьяк, так и ароматические органические загрязнители. Биоразложение последнего может быть полезным; с другой стороны, восстановление As (V) до более подвижного и токсичного As (III) было бы нежелательным.Микроорганизмы, способные восстанавливать арсенат, по-видимому, широко распространены, и, вероятно, будет еще больше штаммов с большим метаболическим и физиологическим разнообразием, которые еще предстоит описать. Как следствие, роль анаэробов в судьбе, переносе и геохимическом цикле мышьяка в окружающей среде еще предстоит полностью оценить.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана программой фундаментальных исследований NIEHS-Superfund (P42ES10344) и частично NSF EMSI (CHE9810248).Мы благодарим Валентина Старовойтова за помощь в просвечивающей электронной микроскопии и Марию Риверу, доктора Крейга Фелпса, Катери Фингер, Хосе Перес-Хименеса, Николаса де Вито и Фанг Лю за техническую поддержку и советы.

Список литературы

[1]

(

1989

)

Виды мышьяка в окружающей среде

.

Chem. Ред.

89

,

713

—

764

. [2]

(

2002

)

Эпидемиология мышьяка и стандарты питьевой воды

.

Science

296

,

2145

—

2146

. [3]

Агентство по охране окружающей среды США

(

2001

).

40 CFR часть 141 и 142, Национальные правила первичной питьевой воды; Мышьяк и разъяснения к соблюдению и мониторингу загрязнителей из новых источников; Окончательное правило. Вашингтон, округ Колумбия: Регистрационный номер Федерального резерва

66

:

6976

–

7066

. [4]

(

1976

)

Окисление арсенита почвенным изолятом Alcaligenes

.

J. Appl. Бактериол.

41

,

295

—

305

. [5]

(

2000

)

Новая хемолитоавтотрофная бактерия, окисляющая арсенит, выделенная из золотого рудника: филогенетические, физиологические и предварительные биохимические исследования

.

заявл. Environ. Microbiol.

66

,

92

—

97

. [6]

(

1991

)

Биогеохимия мышьяка в природных водах: важность метилированных видов

.

Environ. Sci. Technol.

25

,

420

—

427

. [7]

(

2003

)

Жадные водоросли восстанавливают арсенат

.

Лимо. Oceanogr.

48

,

2275

—

2288

. [8]

(

2002

)

Бактериальное дыхание арсената и его значение в окружающей среде

. В:

Экологическая химия мышьяка

(Под ред.), стр.

273

—

275

.

Марсель Деккер

,

Нью-Йорк

. [9]

(

1994

)

Устойчивость микроорганизмов к соединениям мышьяка

.

FEMS Microbiol. Revs.

15

,

355

—

367

. [10]

(

1992

)

Биохимия мышьяка в окружающей среде

.

Rev. Environ. Contam. Toxicol.

124

,

79

—

110

.[11]

(

1994

)

Микроб растет за счет уменьшения содержания мышьяка

.

Природа

371

,

750

. [12]

(

1998

)

Bacillus arsenicoselenatis , sp. nov. и Bacillus selenitireducens , sp. nov .: два галоалкалифила из озера Моно, Калифорния, которые дышат оксианионами селена и мышьяка

.

Arch Microbiol.

171

,

19

—

30

. [13]

(

2002

)

Характеристика микробного восстановления арсената в бескислородных донных водах озера Моно, Калифорния

.

Geomicrobiol. J.

19

,

23

—

40

. [14]

(

2000

)

Дыхание арсената и селената гипертермофильными археями

.

Syst.Прил. Microbiol.

23

,

305

—

314

. [15]

(

1995

)

Рост штамма SES-3 с арсенатом и другими разнообразными акцепторами электронов

.

заявл. Environ. Microbiol.

61

,

3556

—

3561

. [16]

(

1996

)

Chrysiogenes arsenatis gen.nov., sp. nov., новая арсенат-дышащая бактерия, выделенная из сточных вод золотого рудника

.

Внутр. J. Syst. Бактериол.

46

,

1153

—

1157

. [17]

(

2000

)

Две новые арсенат / сульфатредуцирующие бактерии: механизм восстановления арсената

.

Arch Microbiol.

173

,

49

—

57

. [18]

(

1997

)

Осаждение трисульфида мышьяка с помощью Desulfotomaculum auripigmentum

.

заявл. Environ. Microbiol.

63

,

2022

—

2028

. [19]

(

1997

)

Диссимиляционное восстановление арсената и сульфата в Desulfotomaculum auripigmentum sp. ноя

.

Arch. Microbiol.

168

,

380

—

388

. [20]

(

2001

)

Выделение и характеристика новой бактерии, восстанавливающей As (V): значение для мобилизации мышьяка и гена Desulfitobacterium

.

заявл. Environ. Microbiol.

67

,

5568

—

5580

. [21]

(

1999

)

Бактериальное дыхание мышьяка и селена

.

FEMS Microbiol. Ред.

23

,

615

—

627

. [22]

(

2003

)

Экология мышьяка

.

Наука

300

,

939

—

944

. [23]

(

2002

)

Диссимиляционная активность арсенатредуктазы и арсенат-респираторные бактерии в жидкости рубца крупного рогатого скота, фекалиях хомяков и задней кишке термитов

.

FEMS Microbiol. Ecol.

41

,

59

—

67

. [24]

(

1991

)

Разложение толуола и m -ксилола и преобразование o -ксилола путем денитрификации накопительных культур

.

заявл. Environ. Microbiol.

57

,

450

—

454

. [25]

(

2001

)

Изменения в отложениях компонентов фитопланктона в озере, загрязненном Ca ²⁺

.

Environ. Sci. Technol.

35

,

3082

—

3088

. [26]

(

1996

)

Справочная информация

. В:

Лимнологический и инженерный анализ загрязненного городского озера

.

Прелюдия к управлению окружающей средой озера Онондага, Нью-Йорк

(Ред.), Стр.

1

—

31

.

Нью-Йорк

,

Springer-Verlag

. [27]

(

1996

)

Гидрогеологические условия

.В:

Лимнологический и инженерный анализ загрязненного городского озера. Прелюдия к управлению окружающей средой озера Онондага, Нью-Йорк,

(ред.), Стр.

32

—

96

.

Springer-Verlay

,

Нью-Йорк

. [28]

(

1996

)

Озеро Онондага, Нью-Йорк: наследие загрязнения

.

Управление озерами и водохранилищами

12

,

1

—

13

. [29]

(

1997

)

Микробный метаболизм растительных фенольных соединений феруловой и сиреневой кислот в трех анаэробных условиях

.

Microb. Ecol.

33

,

206

—

215

. [30]

(

2002

)

к.т.н. Университет Рутгерса

. [31]

(

1998

)

Американская ассоциация общественного здравоохранения, Американская ассоциация водопроводных сооружений и Федерация водной среды 1998

.

Стандартные методы исследования воды и сточных вод

, 20-е изд.

Американская ассоциация общественного здравоохранения

,

Вашингтон, округ Колумбия

.[32]

(

1976

)

Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель

.

Анал. Биохим.

72

,

248

—

254

. [33]

(

1996

)

Род Nocardiopsis представляет собой филогенетически согласованный таксон и отдельную линию актиномицетов: Предложение Nocardiopsaceae fam.ноя

.

Внутр. J. Syst. Бактериол.

46

,

1088

—

1092

. [34]

(

1991

)

Секвенирование 16S / 23S рРНК

. В:

Методы нуклеиновой кислоты в бактериальной систематике

(ред.), Стр.

115

—

175

.

John Wiley & Sons

,

Нью-Йорк

. [35]

(

1999

)

Новая версия RDP (Ribosomal Database Project)

.

Nucleic Acids Res.

27

,

171

—

173

. [36]

(

1989

)

Быстрое и чувствительное множественное выравнивание последовательностей на микрокомпьютере

.

CABIOS

5

,

151

—

153

. [37]

(

1993

)

PHYLIP (пакет филогенетических выводов), версия 3.5.1

.

Департамент генетики Вашингтонского университета

,

Сиэтл, Вашингтон

.[38]

(

2001

)

Филогенетическое разнообразие рибулозо-1,5-бисфоста карбоксилазы / оксигеназы как генов большой субъединицы из глубоководных микроорганизмов

.

заявл. Environ. Microbiol.

67

,

1751

–

1765

. [39]

(

2003

)

Реклассификация Desulfotomaculum auripigmentum как Desulfosporosinus auripigmentium corrig., Comb. ноя

.

Внутр. J. Syst. Evol. Microbiol.

53

,

1439

—

1443

. [40]

(

2000

)

Pelospora glutarica gen. nov., sp. nov., глутарат-ферментирующие строго анаэробные спорообразующие бактерии

.

Внутр. J. Syst. Evol. Microbiol.

645

—

648

. [41]

(

1995

)

Грамотрицательный спорообразующий анаэроб. Cetobacterium ceti gen. nov., новый грамотрицательный облигатный анаэроб из моря

.

Lett. Прил. Микробный.

21

,

202

—

206

. [42]

(

2000

)

Propionispora vibrioides , nov. ген., ноя. sp., новый грамотрицательный, спорообразующий анаэроб, ферментирующий сахарные спирты

.

Arch. Microbiol.

174

,

239

—

247

.[43]

(

2001

)

Desulfosporosinus meridiei sp. nov., спорообразующая сульфатредуцирующая бактерия, выделенная из загрязненных газолином подземных вод

.

Внутр. J. Syst. Evol. Microbiol.

51

,

133

—

140

. [44]

(

1992

)

Редокс-геохимия мышьяка и железа в Моно-Лейк, Калифорния, США

. В:

Взаимодействие воды и горных пород.Материалы 7-го международного симпозиума

(ред.), Стр.

507

—

511

.

A.A. Balkema Publishers

,

Роттердам

. [45]

(

1998

)

Краткий обзор микробного арсенатного дыхания

.

Geomicrobiol. J.

15

,

255

—

268

. [46]

(

1999

)

Мобилизация мышьяка диссимиляционной Fe (III) -редуцирующей бактерией Shewanella alga BrY

.

Environ. Sci. Technol.

33

,

723

—

729

. [47]

(

2001

)

Мышьяк в подземных водах: тестирование механизмов загрязнения осадочных водоносных горизонтов в Бангладеш

.

Водные ресурсы. Res.

37

,

109

—

117

.

© 2004 Федерация европейских микробиологических обществ. Опубликовано Elsevier Science B.V.Все права защищены.

Ценная стратегия выделения субстратов из сульфоксидредуктаз метионина?

белков, прочно связанных с MSRB1. Вторую элюцию

с использованием дитиотреитола (DTT) проводили для расщепления белков

, возможно, взаимодействующих посредством дисульфидных связей, таких как восстановители MSR

. Этот подход, связанный с масс-спектрометрией

, позволил идентифицировать 24 белка (таблица 1, дополнительная

таблица S1 и дополнительный рис.S1; Дополнительные данные

доступны на сайте www.liebertonline.com/ars). За исключением синтетазы raf-

(RS6) и каталазы 3 (CAT3), все белки были элюированы

без DTT, что указывает на то, что взаимодействие с

MSRB1 не включает дисульфидную связь.

Многие из 13 пластидальных белков, взаимодействующих с MSRB1 di-

, непосредственно участвуют в фотосинтетических процессах, например, a- и b-субъединицы ATP

синтазы, большая субъединица RuBisCO, активаза RuBisCO

(RCA), глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа

(GAPDH) и фосфорибулокиназа (PRK).Другие идентифицированные белки

участвуют в метаболизме аминокислот (ferre-

доксин-зависимая глутамат-синтаза и аспартаткиназа /

гомосериндегидрогеназа), метаболизме сахара (RS6 и

АДФ-глюкозо-пирофосфорилаза (элонгация), трансляция).

фактор tu [EFtu]) и сворачивание белка (шаперонин 60b

[CPN60b]).

Среди 11 непластидных белков несколько общих функций, сходных с функциями пластидных партнеров, например вакуолярная

АТФ-синтаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

GAPC, когнатный фактор элонгации EF2 и один когнитивный фактор теплового шока.

70 кДа.Другими белками, взаимодействующими с MSRB1, являются две ката-

лаз (CAT2 и CAT3), одна актин (ACT2), две тяжелые цепи клатрина

, S-аденозил-1-гомоцистеин гидролаза 1 и предполагаемая 26S протеасома

. регуляторная субъединица.

Очень интересно, что некоторые гомологи партнеров MSRB1,

, такие как каталаза и CPN60b, были зарегистрированы как партнеры MSRB

в H. pylori с использованием стратегии Co-IP (1). Другой,

Synechocystis GADPH, взаимодействует с MSRA в дрожжевых двух гибридных анализах

(7).Тот факт, что родственные белки

связывают MSR с использованием различных подходов у трех организмов, дает

высокую достоверность всех этих результатов. В другом спектре ре-

среди партнеров MSRB1 17 обладают человеческими гомологами

и 12 демонстрируют консервативный Met, который чувствителен к оксидации

в своих родственных белках (3) (дополнительный рис. S1).

Мы также выполнили Co-IP с использованием иммобилизованных антител

против MSRB1, инкубированных с экстрактами листьев растений дикого типа или

растений со сверхэкспрессией MSRB1, параллельно с двумя отрицательными контролями

с использованием msrB1

—

/ msrB2 —

растений с двойным нокаутом или гель

без антител.Только один белок, отсутствующий в отрицательных контролях

, был идентифицирован с помощью масс-спектрометрии. Очень интересно, что этот пластидный * белок, RS6, также был выделен с помощью хроматографии сродства

(Таблица 1), что убедительно свидетельствует о том, что

этот пластидный белок является физиологическим партнером

MSRB1.

Содержание Met в идентифицированных белках

Процент Met во всех партнерах MSRB1 варьирует от 1,5%

до 5,1% (Таблица 1).Мы рассчитали коэффициент корреляции Пирсона, ко-

, эффективный между процентным содержанием Met и содержанием белка во фракциях элюирования

. Сначала мы нормализовали количество пептидов

для каждого белка как функцию от изобилия в экстрактах листьев и

от склонности к триптическому перевариванию. С этой целью мы использовали

нормированный фактор обилия (NAF), экспериментально определенный

завершенный (9). Этот коэффициент представляет собой содержание каждого

белка в листьях с учетом количества

теоретических и соответствующих триптических пептидов.Мы оценили относительное содержание белков

в образцах аффинити-хроматографии

как абсолютное значение продукта белка

NAF по количеству пептидов, идентифицированных масс-спектрометрией

(дополнительная таблица S2). Положительная корреляция

между этой оценкой содержания белка в элюированной фракции

и содержанием Met наблюдалась при вычислении значения коэффициента корреляции

Пирсона (0,621; p <0.05). Самое интересное, что

не наблюдали значимой корреляции ни для каких

из 19 других аминокислот (дополнительная таблица S2). Эти данные

ясно показывают, что белки с высоким содержанием Met

были преимущественно изолированы, и свидетельствуют о специфическом взаимодействии

между MSRB1 и партнерами через окисленный

Met во время процедуры афинитной хроматографии.

Затем мы определили, являются ли остатки Met поверхностными-

открытыми и доступными для окисления в партнерах MSRB1 с помощью

анализа их смоделированных трехмерных структур.Надежные модели

были получены для 16 белков (дополнительная таблица

S3). На всех дисплеях присутствует Met (таблица 1 и дополнительный рисунок

S1), что указывает на то, что они действительно могут составлять подложки для

MSRB1.

Активность пластидных MSRB по отношению к окисленным партнерам

Два пластидных белка были выбраны для дальнейшей характеристики

: RS6, обнаруженный как в афинной хроматографии, так и в

Co-IP, и EFtu, предложенный в качестве субстрата MSR в E.coli (6).

Окисленные рекомбинантные белки анализировали как стратегии MSR sub-

. Активность измеряли как начальную скорость окисления нико-

,

тинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН)

в присутствии пластидных MSRB, MSRB1 или

,

MSRB2 и их специфических восстанавливающих систем. При использовании неокисленных RS6 или EFtu активность

практически не обнаружена.

Innovation

Метионинсульфоксидредуктазы (MSR), ферменты, регенерирующие окисленную форму метионина,

оксид (MetO), присутствуют почти все организмы и имеют

важных функций в защите от окислительных

стрессовых состояний, при старении, а также при нейродегенеративных

заболеваниях.Однако биохимические механизмы, лежащие в основе генетических доказательств критических функций MSR, все еще

неуловимы из-за плохих знаний об их субстратах,

, то есть белках, отображающих MetO, восстановленных MSR. До

было идентифицировано очень мало субстратов MSR, почти все из которых были обнаружены с использованием целевых подходов. Авторы

разработали нецелевой подход, основанный на афин-

хроматографии, для выделения потенциальных субстратов пластидного MSR растений

.Идентифицировано 24 белка, в основном участвующих в фотосинтезе, трансляции и защите от оксида-

стресса, 13 из которых, вероятно, являются релевантными субстратами

из-за их локализации. Статистическое, структурное моделирование

и биохимический анализ в сочетании с литературой

обзор показал, что многие MSRB-взаимодействующие партнеры, вероятно,

представляют собой физиологические субстраты. Стратегия авторов

, основанная на аффинной хроматографии, представляет собой инновационный,

простой в разработке и ценный подход, который может быть применен ко всем организмам

для улавливания субстратов MSR и, таким образом,

для определения роли эти ферменты.

* (http://ppdb.tc.cornell.edu/gene.aspx?id = 22888).

80 TARRAGO ET AL.

Является ли масло CBD индуктором или ингибитором субстрата, дешевый изолят Cbd MindMaster

2021-03-26 Quick Effect — это масло CBD индуктор или ингибитор субстрата и дешевый изолят CBD в продаже.

Мне даже не нужно смотреть на часы, чтобы знать, нет, вы правы, Артур был очень взволнован, конопля cdb Я собираюсь позволить Старому дому дешево изолировать CBD Продукты в нашем доме вернулись к жизни.

Да, это не генерал Цинь, вы действительно можете открыть этот магазин. Ке Бин подошел к Цинь Роу с преувеличенным выражением лица.

Железная дверь жалюзи дешевый изолят CBD CBD Актуальные материалы свернуты. В дверях стоит молодая девушка, продающая цветы.

Лу Сиань вернулся, — пробормотал он. Осуществляет ли Люциан свое желание? Почти, да, почти, но еще не было? Архиепископ ответил неопределенно, дешевый изолят CBD Best CBD Oil, тон Astro Gam Lucian звучал так, будто он не был уверен, кто он такое масло CBD, индуктор или ингибитор субстрат Лосьоны CBD дешевые изоляты CBD Лосьоны CBD говорили, разница между безрецептурным маслом CBD в масле CBD диспансерного качества, что было немного неправильно.

Позвоните законно ли добавлять масло CBD в алкогольные напитки во Флориде правда Вы действительно хотите знать, эта правда Я хочу напомнить вам, как получить масло CBD из картриджей, что правда часто не так прекрасна.

Не удивил Уди Сиань. Миньоны, которых Малик послал раньше, были даже более мощными, чем этот, и ловушки, которые они представляют собой масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата, разработали , были дешевым изолятом CBD Topicals CBD гораздо более дешевым изолятом CBD CBD Oil имеет более сложные преимущества, чем это.

Двое мужчин подошли, чтобы остановить ее, но она была легко свергнута.

Позже дешевые лосьоны CBD изоляты CBD, которые осмелились бы сломать нефритовый павильон, превратились в масло CBD в качестве индуктора или ингибитора субстрата. Лосьоны CBD играют в камень.

Под зеленым, шероховатая поверхность камня — это масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата CBD Lotions , просто масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата CBD Lotions обычный камень.

В последний раз, о партии каменных материалов, было действительно ли масло CBD помогает от боли для онкологических больных действительно новости, но не то, что дешевый изолят CBD Best CBD Oil сказал Ке Бин, Hengyuan не приобрел партию камней, и теперь дешевый изолят CBD Интернет-магазин те камни дешевые изолят CBD Купить CBD Cream также были приняты, чтобы уничтожить, Ке Бин сделал, по сути, это сознательно разбил Сяо Ян, стоящий рядом с Цинь Роу, улыбнулся.

Малыш, это то, что ты сказал, чтобы пожелать тебе семейной двери. Вы не можете даже дешевый изолятор cbd войти в дверь, мистер.

Я не делал таких жестоких упражнений много веков, — усмехнулся Люциан.

Каждый присел на корточки для Удиссейна из дешевого изолята CBD Best CBD Brand и выразил ему самую искреннюю благодарность, сколько капель масла CBD 500 мг потребовалось принять человек весом 158 фунтов, но их действия заставили Удисси почувствовать себя очень смущенным.

Когда она это сделала, Удисян продолжил. Сказал, что если это сработает, я дешевый изолят CBD Oil Benefits придет к Кейджу, и я буду знать больше о том, как продемонстрировать это всем.

Низкая пощечина от покупки 1 мл картриджа двойная керамическая катушка масло cbd воск vape крутой склон дешевый cbd изолят CBD Store Online на его — масло cbd индуктор или ингибитор субстрата слева, Udysian s cannabis nation sunriver heart внезапно упоминается в глазах слепых.

Отказ Г-н Ю, вы как улучшить вкус масла CBD серьезно xanax и масло CBD — масло CBD индуктор или ингибитор субстрата Лосьоны CBD Да, MindMaster — масло CBD как индуктор или ингибитор субстрата серьезный.Ю. Преимущества и использование дешевого изолята CBD Вэй кивнул. Где купить масло CBD в качестве индуктора или ингибитора субстрата — это решение, принятое лидером — масло CBD в качестве индуктора или ингибитора субстрата .

Через некоторое время он начал смотреть на все, чтобы стать онлайн-продавцом масла CBD, перед ним в замешательстве, а затем, по-видимому, испугался.

В конце концов, является ли масло CBD индуктором или ингибитором субстрата. Лосьоны CBD — масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата. Ахиллиос.

Они не стали бы покупать высококачественное чистое масло CBD, полученное из марихуаны. DC подозревает, что три военных корабля только напугали себя.

Я знаю, Лилия, я уже знаю. Седрик и еще один слуга дешевого изолята CBD Best CBD Oil также постигла та же участь.

Некоторые верующие вполне понимают, где купить масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата. Где купить масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата. C Самый продаваемый продукт — масло CBD, индуктор или ингибитор субстрат они часто слабы. C Архиепископ и его последователи выскакивают из толпы и уносят их на специальное миссионерское поле.

Доктор Нин посмотрел на тысячу долларов в руках Цю Ю и дешевый изолят CBD Best CBD Oil нахмурился.

Считаю излишнюю скромность гордостью. Моя сила, вложенная в молодых. Где купить масло CBD как индуктор или ингибитор поколения субстратов в Китае, — это преимущества и использование дешевого изолята CBD, непобедимый Когда я говорю, где купить масло CBD как индуктор или ингибитор субстрата непобедимое слово «тело Чжу Чжун» излучает сильную уверенность.

Стоя в будущем, Байчи нервно посмотрел на Сяояна в лаборатории.

Вне дома — масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата. Большая распродажа из Эссена, цветы, еда и даже дешевые лосьоны CBD изолят CBD были оставлены позади, и они незаметно ушли.

В то время я не знал, откуда звук. . Могу ли я дать собаке масло CBD из аптеки. — масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата. Лосьоны CBD. , сопровождаемый ревом, дешевым изолятом CBD Best CBD Oil, который звучал как зверь. Самый продаваемый продукт — масло CBD как индуктор или ингибитор субстрата из горла.

Удисиан просто хотел предупредить, что отсканированное масло CBD можно использовать после облучения для получения энергии им масло CBD для лечения хронической боли, чтобы обратить внимание помогает ли масло CBD синдрому синдром дырявого кишечника от падения и дешево изолят cbd Купить CBD Cream сейчас как использовать терпены cbd , атакующие его.

Лорен чувствует, что не может дышать, она закрыла глаза. Время на MindMaster — это масло индуктора или ингибитора момента субстрата — 17 22.

Императорский камень, зажатый в центре, был описан местным мастером фэн-шуй как тренд звезд.

Затем она ахнула и села. Что случилось? Что случилось? Что случилось? Ее глаза были в панике.

Фермер отвел взгляд, но не смог прорвать заклинания, выпущенные жертвой.

Сяо Ян дешевый изолят CBD Продукты CBD увидели, что врачом клиники был мужчина почти 50 лет, в очках и у него было , можете ли вы дать собакам вакцины и масло CBD в тот же день рост один метр восемь , который выглядел очень тонким.

Мальчик, который испугался и расширил свой дешевый изолят CBD для глаз, был Седрик, но он быстро стабилизировал свое тело и сохранил масло CBD в качестве индуктора или ингибитора субстрата CBD Lotions вместе с Udi Xi an.

Да, ничего не скажешь. Где купить масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата большой здесь. Когда у вас есть способность создавать свою собственную силу, вы знаете, насколько это сложно.

Менеджер в вестибюле шагнул вперед, врезался в лицо Гуо Вэньци и закричал: «Как у вас дела?» — масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата. Большая распродажа. Ву Шао лично называл его «Извините, извините».

После катастрофы с дешевым изолятом CBD Lotions из Салема, дешевый изолят CBD Products, сын Делл Мидис, впервые почувствовал, что он Самый продаваемый продукт — масло CBD как индуктор или ингибитор субстрата , как и обычный человек.

Кто-то их встретил далеко. Уди Сиан чувствовал, что никто из них не приезжал в Пассу, и он был поражен энтузиазмом, что MindMaster использует масло CBD в качестве индуктора или ингибитора субстрата для этой аварии.

Может, он никогда не устанет бегать. Как только люди из Пассы обнаружат его обман, они определенно будут сердиться на дешевые лосьоны CBD изоляты CBD сначала, но вскоре они будут продавать 1000 мг масла каннабидиола CBD чувствовать дешевый изолят CBD Масло CBD Преимущества, что в мире есть справедливость.

В настоящее время они должны быть , сколько времени требуется капсулам CBD из конопляного масла, при регулярном патрулировании, и они являются маслом CBD как индуктором или ингибитором субстрата. время от времени приветствуется соседями.

Женщина-врач прошла мимо стеклянного окна палаты. Масло, нанесенное на кожу от боли, Пол округлил глаза.

Пусть войдет фальшивый доктор. Сяо Ян сказал равнодушно.

Она хотела броситься в пустыню и позволить ему медленно понести наказание за то, что он осмелился сражаться с женщиной-дьяволом.

— масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата. Большая распродажа. Официант быстро пришел дешевый изолят CBD. Купил CBD Cream и удалил все блюда.На самом деле, эта таблица Посуды можно использовать масло CBD в пазухах для ушной инфекции также почти съедены.

Борн жестом указал Лорен в стеклянную комнату, а затем указал пальцем на определенное место на экране мозга пациента.

В соответствии со статьей cbd oil utah 50mg cbd капсулы 2 новых внутренних правил больницы, Пол настаивал, мой мобильный телефон Преимущества и использование дешевого изолята cbd можно использовать в этом зале. Ваш новый продает ли на рынке мам cbd В Бриссоне действуют правила под названием масло , так что вы все еще торопитесь.

Этот куст вырос в несколько раз за мгновение и превратился из гниющего в лиственный.

На самом деле очень хороший кубинец. Когда он танцевал, он был как Бог, дешевый изолят CBD, и он был полон энергии.

Тебе не нужно работать сегодня отзывов клиентов о масле evo heal cbd Я выполнил задачу вчера вечером в течение дня.

Согласно прошлому, этот кусок Ван Ши, когда дешевый изолятор CBD в Интернет-магазине покупается, он должен быть сотнями тысяч.

Когда эти молодые люди начинают практиковать после того, как их выбрали, в чем разница между маслом CBD и маслом конопли высокопоставленными священниками, им не нужно носить костюмы, которые представляют учение определенной ветви, потому что архиепископы надеются, что дешевые CBD изолируют CBD Интернет-магазин, что у них есть бесплатные образцы увеличения пениса, время, чтобы выбрать свой любимый жанр.

Как они могут не поверить в это Как раз перед ними, , где можно купить натуральное масло CBD , первый дешевый изолят CBD Руководство пользователя CBD Инспектор был убит громом, а затем глава дешевого изолята CBD Pure CBD Oil Guard — CBD Масло индуктор или ингибитор субстрата Big Sale был задушен собственным оружием.

Lauren — масло cbd индуктор или ингибитор субстрата простонал. Итак, вы являетесь маслом CBD индуктором или ингибитором субстрата CBD Lotions , так что вам так не терпится попросить компьютерную томографию.

Только через два дня они нашли вдову мэра Эссена.

Ее голос полон фанатизма. Где купить масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата, а так близко к магазинам, где продают масло CBD, безумный тон — это то, чего он никогда раньше не слышал.

Джин Синь и другие, только почувствуйте сильный импульс, источайте от морского бога, это дешевый изолят cbd Купить CBD Cream импульс, позвольте им почувствовать дыхание.

Их ужасная броня полностью отличается от стражей мира стражей.

Гу Фанг, стоя на палубе, где купить масло CBD, индуктор или ингибитор субстрата, круизный дешевый изолят CBD, корабль CBD Products, увидел скоростной катер, приближающийся к его is cbd oil индуктор или ингибитор субстрата боковая сторона.

Перейти дешево изолят CBD Лучшее масло CBD для путешествий. Подойдите к окну, чтобы путешествовать. Нет, это значит ехать из окна. Она сделала то, что желает другой дешевый изолят CBD Pure CBD Oil, с легкой насмешливой улыбкой на губах.

Пять тысяч Пять тысяч Звук цены в коробке на втором этаже заставил всех в комнате почувствовать себя неловко.

журналов открытого доступа | OMICS International

Дом О нас Открытый доступ Журналы Поиск по теме Журнал открытого доступа Acta Rheumatologica Журнал открытого доступа Достижения в профилактике рака Журнал открытого доступа Американский журнал этномедицины Американский журнал фитомедицины и клинической терапии Обезболивание и реанимация: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа Анатомия и физиология: текущие исследования Журнал открытого доступа Андрология и гинекология: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа Андрология — открытый доступ Журнал открытого доступа Анестезиологические коммуникации Ангиология: открытый доступ Журнал открытого доступа Летопись инфекций и антибиотиков Журнал открытого доступа Архивы исследований рака Журнал открытого доступа Архив расстройств пищеварения Архивы медицины Журнал открытого доступа Archivos de Medicina Журнал открытого доступа Рак груди: текущие исследования Журнал открытого доступа Британский биомедицинский бюллетень Журнал открытого доступа Отчет о слушаниях в Канаде Журнал открытого доступа Химиотерапия: открытый доступ Официальный журнал Итало-латиноамериканского общества этномедицины Хроническая обструктивная болезнь легких: открытый доступ Журнал открытого доступа Отчеты о клинических и медицинских случаях Журнал клинической гастроэнтерологии Журнал открытого доступа Клиническая детская дерматология Журнал открытого доступа Колоректальный рак: открытый доступ Журнал открытого доступа Косметология и хирургия лица Журнал открытого доступа Акушерство и гинекология интенсивной терапии Журнал открытого доступа Текущие исследования: интегративная медицина Журнал открытого доступа Стоматологическое здоровье: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа Стоматология Журнал открытого доступа, Официальный журнал Александрийской ассоциации оральной имплантологии, Лондонская школа лицевой ортотропии Дерматология и дерматологические заболевания Журнал открытого доступа Отчеты о случаях дерматологии Журнал открытого доступа Диагностическая патология: открытый доступ Журнал открытого доступа Неотложная медицина: открытый доступ Официальный журнал Всемирной федерации обществ педиатрической интенсивной и интенсивной терапии Эндокринология и диабетические исследования Гибридный журнал открытого доступа Эндокринология и метаболический синдром Официальный журнал Ассоциации осведомленности о СПКЯ Эндокринологические исследования и метаболизм Эпидемиология: открытый доступ Журнал открытого доступа Европейский журнал спорта и науки о физических упражнениях Доказательная медицина и практика Журнал открытого доступа Семейная медицина и медицинские исследования Журнал открытого доступа Лечебное дело: открытый доступ Журнал открытого доступа Гинекология и акушерство Журнал открытого доступа, Официальный журнал Ассоциации осведомленности о СПКЯ Отчет о гинекологии и акушерстве Журнал открытого доступа Лечение волос и трансплантация Журнал открытого доступа Исследования рака головы и шеи Журнал открытого доступа Гепатология и панкреатология Фитотерапия: открытый доступ Журнал открытого доступа Анализ артериального давления Журнал открытого доступа Информация о заболеваниях грудной клетки Журнал открытого доступа Информация о гинекологической онкологии Журнал открытого доступа Внутренняя медицина: открытый доступ Журнал открытого доступа Международный журнал болезней органов пищеварения Журнал открытого доступа Международный журнал микроскопии Международный журнал физической медицины и реабилитации Журнал открытого доступа JOP.Журнал поджелудочной железы Журнал открытого доступа Журнал аденокарциномы Журнал открытого доступа Журнал эстетической и реконструктивной хирургии Журнал открытого доступа Журнал старения и гериатрической психиатрии Журнал артрита Журнал открытого доступа Журнал спортивного совершенствования Гибридный журнал открытого доступа Журнал автакоидов и гормонов Журнал крови и лимфы Журнал открытого доступа Журнал болезней крови и переливания Журнал открытого доступа, Официальный журнал Международной федерации талассемии Журнал исследований крови и гематологических заболеваний Журнал открытого доступа Журнал отчетов и рекомендаций по костям Журнал открытого доступа Журнал костных исследований Журнал открытого доступа Журнал исследований мозга Журнал клинических испытаний рака Журнал открытого доступа Журнал диагностики рака Журнал открытого доступа Журнал исследований рака и иммуноонкологии Журнал открытого доступа Журнал онкологической науки и исследований Журнал открытого доступа Журнал канцерогенеза и мутагенеза Журнал открытого доступа Журнал кардиологической и легочной реабилитации Журнал клеточной науки и апоптоза Журнал детства и нарушений развития Журнал открытого доступа Журнал детского ожирения Журнал открытого доступа Журнал клинических и медицинских тематических исследований Журнал клинической и молекулярной эндокринологии Журнал открытого доступа Журнал клинической анестезиологии: открытый доступ Журнал клинической иммунологии и аллергии Журнал открытого доступа Журнал клинической микробиологии и противомикробных препаратов Журнал клинических респираторных заболеваний и ухода Журнал открытого доступа Журнал коммуникативных расстройств, глухих исследований и слуховых аппаратов Журнал открытого доступа Журнал врожденных заболеваний Журнал контрацептивных исследований Журнал открытого доступа Журнал стоматологической патологии и медицины Журнал диабета и метаболизма Официальный журнал Европейской ассоциации тематической сети по биотехнологиям Журнал диабетических осложнений и медицины Журнал открытого доступа Журнал экологии и токсикологии Журнал открытого доступа Журнал судебной медицины Журнал открытого доступа Журнал желудочно-кишечной и пищеварительной системы Журнал открытого доступа Журнал рака желудочно-кишечного тракта и стромальных опухолей Журнал открытого доступа Журнал генитальной системы и заболеваний Гибридный журнал открытого доступа Журнал геронтологии и гериатрических исследований Журнал открытого доступа Журнал токсичности и болезней тяжелых металлов Журнал открытого доступа Журнал гематологии и тромбоэмболических заболеваний Журнал открытого доступа Журнал гепатита Журнал открытого доступа Журнал гепатологии и желудочно-кишечных расстройств Журнал открытого доступа Журнал ВПЧ и рака шейки матки Журнал открытого доступа Журнал гипертонии: открытый доступ Журнал открытого доступа, Официальный журнал Словацкой лиги против гипертонии Журнал визуализации и интервенционной радиологии Журнал открытого доступа Журнал интегративной онкологии Журнал открытого доступа Журнал почек Журнал открытого доступа Журнал лейкемии Журнал открытого доступа Журнал печени Журнал открытого доступа Журнал печени: болезни и трансплантация Гибридный журнал открытого доступа Журнал медицинской и хирургической патологии Журнал открытого доступа Журнал медицинских диагностических методов Журнал открытого доступа Журнал медицинских имплантатов и хирургии Журнал открытого доступа Журнал медицинской онкологии и терапии Журнал медицинской физики и прикладных наук Журнал открытого доступа Журнал медицинской физиологии и терапии Журнал медицинских исследований и санитарного просвещения Журнал медицинской токсикологии и клинической судебной медицины Журнал открытого доступа Журнал метаболического синдрома Журнал открытого доступа Журнал микробиологии и патологии Журнал молекулярной гистологии и медицинской физиологии Журнал открытого доступа Журнал молекулярной патологии и биохимии Журнал морфологии и анатомии Журнал молекулярно-патологической эпидемиологии MPE Журнал открытого доступа Журнал неонатальной биологии Журнал открытого доступа Журнал новообразований Журнал открытого доступа Журнал нефрологии и почечных заболеваний Журнал открытого доступа Журнал нефрологии и терапии Журнал открытого доступа Журнал исследований нейроэндокринологии Журнал новых физиотерапевтов Журнал открытого доступа Журнал расстройств питания и терапии Журнал открытого доступа Журнал ожирения и расстройств пищевого поведения Журнал открытого доступа Журнал ожирения и терапии Журнал открытого доступа Журнал терапии ожирения и похудания Журнал открытого доступа Журнал ожирения и метаболизма Журнал одонтологии Журнал онкологической медицины и практики Журнал открытого доступа Журнал онкологических исследований и лечения Журнал открытого доступа Журнал трансляционных исследований онкологии Журнал открытого доступа Журнал гигиены полости рта и здоровья Журнал открытого доступа, Официальный журнал Александрийской ассоциации оральной имплантологии, Лондонская школа лицевой ортотропии Журнал ортодонтии и эндодонтии Журнал открытого доступа Журнал ортопедической онкологии Журнал открытого доступа Журнал остеоартрита Журнал открытого доступа Журнал остеопороза и физической активности Журнал открытого доступа Журнал отологии и ринологии Гибридный журнал открытого доступа Журнал детской медицины и хирургии Журнал по лечению боли и медицине Журнал открытого доступа Журнал паллиативной помощи и медицины Журнал открытого доступа Журнал периоперационной медицины Журнал физиотерапии и физической реабилитации Журнал открытого доступа Журнал исследований и лечения гипофиза Журнал беременности и здоровья ребенка Журнал открытого доступа Журнал профилактической медицины Журнал открытого доступа Журнал рака простаты Журнал открытого доступа Журнал легочной медицины Журнал открытого доступа Журнал пульмонологии и респираторных заболеваний Журнал редких заболеваний: диагностика и терапия Журнал регенеративной медицины Гибридный журнал открытого доступа Журнал репродуктивной биомедицины Журнал сексуальной и репродуктивной медицины подписка Журнал спортивной медицины и допинговых исследований Журнал открытого доступа Журнал стероидов и гормональной науки Журнал открытого доступа Журнал хирургии и неотложной медицины Журнал открытого доступа Журнал хирургии Jurnalul de Chirurgie Журнал открытого доступа Журнал тромбоза и кровообращения: открытый доступ Журнал открытого доступа Журнал заболеваний щитовидной железы и терапии Журнал открытого доступа Журнал традиционной медицины и клинической натуропатии Журнал открытого доступа Журнал травм и лечения Журнал открытого доступа Журнал травм и интенсивной терапии Журнал исследований опухолей Журнал открытого доступа Журнал исследований и отчетов по опухолям Журнал открытого доступа Журнал сосудистой и эндоваскулярной терапии Журнал открытого доступа Журнал сосудистой медицины и хирургии Журнал открытого доступа Журнал женского здоровья, проблем и ухода Гибридный журнал открытого доступа Журнал йоги и физиотерапии Журнал открытого доступа, Официальный журнал Федерации йоги России и Гонконгской ассоциации йоги La Prensa Medica Контроль и ликвидация малярии Журнал открытого доступа Материнское и детское питание Журнал открытого доступа Медицинские и клинические обзоры Журнал открытого доступа Медицинская и хирургическая урология Журнал открытого доступа Отчеты о медицинских случаях Журнал открытого доступа Медицинские отчеты и примеры из практики в открытом доступе Нейроонкология: открытый доступ Журнал открытого доступа Медицина труда и здоровье Журнал открытого доступа Радиологический журнал OMICS Журнал открытого доступа Отчеты о онкологии и раковых заболеваниях Журнал открытого доступа Здоровье полости рта и лечение зубов Журнал открытого доступа Официальный журнал Лондонской школы лицевой ортотропии Отчеты о заболеваниях полости рта Журнал открытого доступа Ортопедическая и мышечная система: текущие исследования Журнал открытого доступа Отоларингология: открытый доступ Журнал открытого доступа Заболевания поджелудочной железы и терапия Журнал открытого доступа Педиатрическая помощь Журнал открытого доступа Скорая педиатрическая помощь и медицина: открытый доступ Журнал открытого доступа Педиатрия и медицинские исследования Педиатрия и терапия Журнал открытого доступа Пародонтология и протезирование Журнал открытого доступа Психология и психиатрия: открытый доступ Реконструктивная хирургия и анапластология Журнал открытого доступа Отчеты в рака и лечения Отчеты в маркерах заболеваний Отчеты в исследованиях щитовидной железы Репродуктивная система и сексуальные расстройства: текущие исследования Журнал открытого доступа Исследования и обзоры: Journal of Dental Sciences Журнал открытого доступа Исследования и обзоры: медицинская и клиническая онкология Исследования и отчеты в гастроэнтерологии Журнал открытого доступа Исследования и отчеты в области гинекологии и акушерства Кожные заболевания и уход за кожей Журнал открытого доступа Хирургия: текущие исследования Официальный журнал Европейского общества эстетической хирургии Трансляционная медицина Журнал открытого доступа Травмы и неотложная помощь Журнал открытого доступа Тропическая медицина и хирургия Журнал открытого доступа Универсальная хирургия Журнал открытого доступа Всемирный журнал фармакологии и токсикологии

Аналог планеты — использование глубоких скважин N ​​в аналоговом дизайне

В обычном процессе CMOS (см. Рисунок 1) устройства NMOS формируются в P-углублении или подложке, подключенной к земле (или самому отрицательному источнику питания в цепи).Устройства PMOS сформированы в колодце N, подключенном к наиболее положительному источнику питания.

Рисунок 1

Типичное поперечное сечение инвертора CMOS. Токи шума от подложки показаны красными линиями.

Шум от подложки, вызванный инжекцией неосновных носителей в подложку и лунку, можно улавливать с помощью заглушек и / или защитных колец. Дополнительная проблема существует в том, что емкостная связь шума от лунки к подложке означает, что больше шума достигает источника питания.В цифровых схемах это обычно не проблема из-за относительно высокой помехоустойчивости логических вентилей. Однако в аналоговой конструкции, например в 12-битном АЦП, шум может стать серьезной проблемой. Для минимизации этого шума можно использовать различные методы, например, удерживая аналоговые устройства окруженными защитными кольцами или используя отдельный источник питания для отводов субстрата / лунок. Однако сами по себе защитные кольца не могут предотвратить шумовую связь глубоко в подложке, а только поверхностные токи.

Другая проблема в том, что невозможно изолировать устройства NMOS.Таким образом, относительно шумная цифровая логика не может быть полностью изолирована от более чувствительных аналоговых областей.

Решение состоит в том, чтобы изолировать устройства NMOS с помощью дополнительной лунки — «глубокой лунки N». Итак, на рисунке 2 устройство NMOS изготовлено в P-лунке или подложке, полностью окруженной диффузией N-типа.

Рисунок 2

Поперечное сечение КМОП-преобразователя с глубокой N-образной ячейкой Токи шума от подложки показаны красными линиями.

В этом случае глубокая яма N образована имплантацией высокоэнергетических ионов, чтобы получить достаточно глубокую пиковую концентрацию примесей, чтобы не повлиять на производительность устройства NMOS. ¹ .Соединение с глубокой N-образной скважиной формируется кольцом N-образной скважины, которое подключено к VDD.